王 萌 ，楊 柳 ，楊風(fēng)蕊 ，閻 嘉 ，孟 林

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津300070；2.天壇生物制品股份有限公司，北京100024）

東北鶴虱（Lappula Echinata Gilib，LEG）為紫草科植物東北鶴虱的果實，盛產(chǎn)于我國華北、東北等地區(qū)。藥書記載，其味苦、辛、平，入脾、胃、肝三經(jīng)，可治療蟲積腹痛[1]，民間用其果實或全草水煎治療各種腹疼、腹瀉，尤其對慢性、遷延性腹瀉有獨到的療效。前期研究證明其提取物L(fēng)EGPS-Ⅱ?qū)α馨图?xì)胞及巨噬細(xì)胞功能有增強或調(diào)節(jié)作用[2-3]，本文旨在研究該提取物對小鼠巨噬細(xì)胞氧化損傷是否有保護作用，進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和藥物 LEG產(chǎn)地為我國黑龍江省，種子類藥材，呈卵形，長約3～3.5mm，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)教研室于加賓教授鑒定。取干燥的LEG，粉碎至20目，水煎煮，過濾除藥渣后合并藥液，以水提醇沉法及Sevag法收集并除蛋白，得到粉末狀淡黃色提取物L(fēng)EG-I。LEG-I經(jīng)陰離子交換柱層析再濃縮透析凍干得東北鶴虱提取物（LEGPS-Ⅱ），淡黃色粉末，易溶于水，純度為38.7%。藥物用PBS緩沖液配制成1mg/mL儲備液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃冰箱保存，臨用前用PBS緩沖液稀釋成所需濃度。

RPMI-1640培養(yǎng)液，北京天潤善達生物科技有限公司；超級新生牛血清，美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（Methyl thiazolyl tetrazole,MTT），瑞士 Fluka公司；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO），美國Amresco公司；一氧化氮（NO）測試盒(硝酸還原酶法)，南京建成生物研究所，批號20101229；分型一氧化氮合成酶（NOS）測試盒，南京建成生物研究所，批號20101220；BCA蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所；總超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20110104；微量丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20101228。

1.1.2 實驗動物 近交系清潔級昆明種小鼠，體質(zhì)量均為（20±0.25）g，4～6 周齡，雌雄不拘，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心（批準(zhǔn)文號：SCXK-2010-003），實驗前置動物于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，不限食水，室溫18～22℃，相對濕度50%～70%。

1.1.3 儀器 SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Forma SeriesⅡ型二氧化碳孵箱（Thermo Electron Corporation）；CK40生物倒置顯微鏡（Olympus）；Model680型酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；超聲波細(xì)胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BFX5-320型低速自動平衡離心機（白洋離心機廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 昆明種小鼠1只，頸椎脫臼處死，完全浸入75%酒精內(nèi)消毒5min后取出，移入超凈臺內(nèi)固定其四肢。小鼠腹腔內(nèi)注入冷PBS緩沖液5mL，輕揉腹部5min后，用眼科剪小心剪開腹部皮膚，暴露腹膜。于腹膜上剪一小口，用無菌吸管深入腹腔內(nèi)吸回PBS液。將吸出液離心1 500 r/min 10min后棄上清，用含10%超級新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸沉淀。臺盼藍(lán)測定細(xì)胞存活率為90%以上，計數(shù)，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL。無菌條件下收集正常小鼠腹腔MΦ懸液完畢。

1.2.2 LEGPS-Ⅱ?qū)π∈蟾骨痪奘杉?xì)胞活性的影響 RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL接種于96孔板，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為5組：正常對照組：加入等量培養(yǎng)液，不加任何藥物；HO損傷組：加入終濃度0.2mmol/L的H2O2作用0.5 h；LEGPS-Ⅱ（30，60，120 μg/mL）保護組：分別加入不同濃度的LEGPS-Ⅱ孵育3 h后加入0.2mmol/L的H2O2，繼續(xù)孵育0.5 h。每個濃度組設(shè)重復(fù)孔6個，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，后棄原培養(yǎng)基，各孔加入含MTT 20μL（終濃度0.5mg/L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100μLDMSO，震蕩5min，用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定吸光度值，以 OD測定組/OD對照組×100%計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 NO、T-SOD、MDA的測定 實驗分組同上，指標(biāo)測定按南京建成生物工程研究所試劑盒方法操作。

1.2.4 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的測定 將巨噬細(xì)胞接種于6孔板中，實驗分組同上，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，將培養(yǎng)液在室溫條件下1 000 r/min離心10min，棄上清留細(xì)胞沉淀。在細(xì)胞沉淀中加入0.5～1mL的生理鹽水（等滲），輕輕顛倒混勻，將培養(yǎng)液在室溫條件下1 000 r/min離心10min，棄上清留細(xì)胞沉淀。重復(fù)這一操作1～2次。超聲破碎細(xì)胞，功率300W，每3~5 s超聲1次，間隔4次（每次間隔時間30 s～1min），超聲過程中保證冰水浴。最后1 000 r/min離心10min，所得上清即為樣品。樣品按南京建成生物工程研究所試劑盒方法操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果均以形式表示。多樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（ONEWAY ANOVA），方差齊者采用LSD法檢驗，方差不齊者采用Dunnett’s T3法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LEGPS-Ⅱ?qū)2O2損傷的巨噬細(xì)胞存活率的影響 見圖1。

與對照組比較，H2O2處理使細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.01）；與H O 組比較，LEGPS-Ⅱ各濃度組均顯著提高細(xì)胞存活率（P<0.05，P<0.01），且各給藥組之間差異也有顯著性（P<0.05，P<0.01）。

2.2 LEGPS-Ⅱ?qū)π∈蟾骨痪奘杉?xì)胞NO及其合酶的影響 與對照組相比，H2O2損傷組NO的含量增加1倍以上（P<0.01）、iNOS活力提高2倍（P<0.01）；與H2O2組相比，LEGPS-Ⅱ各濃度組均使NO的含量降低（P<0.05，P<0.01）、iNOS 的活力下降，且各組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05，P<0.01）。見圖 2、3。

2.3 LEGPS-Ⅱ?qū)π∈蟾骨痪奘杉?xì)胞SOD的影響與對照組比較，H2O2處理使T-SOD活力顯著降低（P<0.01）；與H2O2組相比，LEGPS-Ⅱ各濃度組均顯著提高T-SOD活力（P<0.05，P<0.01），但60μg/mL及120μg/mL LEGPS-Ⅱ給藥組之間T-SOD活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

2.4 LEGPS-Ⅱ?qū)π∈蟾骨痪奘杉?xì)胞MDA的影響 與對照組比較，H2O2處理使MDA含量明顯升高（P<0.01)；與H2O2組相比，LEGPS-Ⅱ各組均顯著降低MDA含量（P<0.01），且各組間均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖 5。

3 討論

自由基是一種含有不成對電子的原子、分子或基團。超氧陰離子O2-·、羥自由基·OH、過氧化氫H2O2等通常稱為活性氧自由基（ROS）。NO是一種小分子氣體，含有一個未配對的電子，因而具有自由基性質(zhì)。NO·及其生物體內(nèi)激發(fā)產(chǎn)物統(tǒng)稱為活性氮自由基（RNS）。生理情況下機體產(chǎn)生的自由基很少并參與機體的多種生理生化過程，體內(nèi)還存在抗自由基系統(tǒng)：一類是酶性防御系統(tǒng)，包括SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)等；另一類是非酶性防御系統(tǒng)，包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽（glutathione,GSH）[4-5]等。它們對清除自由基、保護細(xì)胞及機體正常生理功能起重要作用。氧化應(yīng)激是指由于OFR過量生成或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導(dǎo)致OFR及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。ROS和RNS均可引起氧化應(yīng)激。

H2O2是一種重要的ROS，極易透過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過反應(yīng)形成高活性的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，其易于獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，所以它已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具。本實驗以H2O2造成小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，觀察東北鶴虱提取物L(fēng)EGPS-Ⅱ的抗氧化損傷作用[6]。

iNOS主要分布于巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞等，當(dāng)受到某些細(xì)胞因子，如內(nèi)毒素、白介素、脂多糖及干擾素刺激后而表達。NO是在iNOS催化下L-精氨酸生成L-瓜氨酸的反應(yīng)中形成的小分子氣體自由基，研究證實NO在各種炎性疾病病理過程中起重要作用，炎性反應(yīng)時，主要由巨噬細(xì)胞生成NO。適量的NO有助于殺滅病原微生物、減輕炎性反應(yīng)等，但過量的NO可與超氧陰離子（O2-）等氧自由基反應(yīng)，表現(xiàn)為明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。本實驗中，H2O2處理使巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中iNOS活力增加，NO含量明顯升高，提示H2O2可引起巨噬細(xì)胞氧化損傷。在LEGPS-Ⅱ的干預(yù)下，iNOS活力明顯降低，NO含量明顯減少。由iNOS催化合成的NO是介導(dǎo)細(xì)胞毒性的NO的主要來源，刺激因素下細(xì)胞內(nèi)iNOS是NO產(chǎn)生的重要限速酶[7-8]，提示LEGPS-Ⅱ可能是通過抑制iNOS表達從而抑制細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)生，因而發(fā)揮抗氧化作用。

SOD催化O2-歧化為O2和H2O2。此酶是已知抗氧化酶系中速率最快的抗氧化酶之一，Vmax約為2×109mol/Ls。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，保護機體免受ROS損傷，其值可以間接反映機體清除ROS的能力[9]。本實驗在H2O2誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化損傷中，LEGPS-Ⅱ能提高巨噬細(xì)胞T-SOD活力，發(fā)揮抗氧化作用。

體內(nèi)最重要的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物是MDA[10]，MDA為極活潑的交聯(lián)劑，隨即與磷脂酰乙醇胺交聯(lián)成熒光色素，然后與蛋白質(zhì)、肽類或脂質(zhì)結(jié)合成難溶性的無生理活性的色素斑點，沉積于細(xì)胞內(nèi)，稱為脂褐素。因此MDA是反映機體ROS損害的指標(biāo)，測試MDA的量不僅可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，而且可間接反映細(xì)胞受ROS攻擊而損傷的程度[11-12]。本實驗中，LEGPS-Ⅱ能降低H2O2損傷下巨噬細(xì)胞MDA的含量，減少脂質(zhì)過氧化損傷。

本實驗結(jié)果表明，東北鶴虱提取物L(fēng)EGPS-Ⅱ?qū)ψ杂苫哂星宄饔?，能抑制iNOS表達而減少細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)生，能減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成量,還能提高抗氧化酶SOD活性，表現(xiàn)出多種途徑的抗氧化作用。東北鶴虱具有廣泛的生物活性，而抗氧化損傷是其重要的作用機制之一。

[1]冉先德.中華藥海[M].哈爾濱:哈爾濱出版社,1987:1062-1064[2]于躍，楊柳，郭秀英，等.東北鶴虱水提取物對小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖、分泌IL-2和TNF-α的作用[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，16（3）:424

[3]楊柳，王萌，于躍，等.東北鶴虱多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，17（3）：328

[4]徐敏.論人體的自由基和抗氧化劑-谷胱甘肽[J].醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)資訊，2006，3（2）∶127

[5]譚峰，劉群良，張月娟，等.還少丹對大鼠谷胱甘肽過氧化物酶活性及丙二醛含量影響的研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，12（7）:1

[6]帥學(xué)宏，胡庭俊，張霞,等.蕨麻多糖組分抑制過氧化氫誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的作用[J].藥學(xué)學(xué)報，2009，44（9）:987

[7]Olas B,Saluk Juszczak J,Pawlaczyk I,etal.Antioxidant and anti aggregatory effects of an extract from Conyza canadensis on blood platelets in vitro[J].Platelets,2006,17（6）:354

[8]楊學(xué)禮，馮娟.一氧化氮的生物效應(yīng)及其作川機制的研究[J].生理科學(xué)進展，2008，39（1）:91

[9]Barba I,Chavarria L,Ruiz-Meana M.Effect of intracellular lipid dropletson cytosolic Ca2+and celldeath during ischaemia-reperfusion injury in cardiomyocytes[J].JPhysiol,2009,587（6）:1331

[10]熊彥紅，齊雙巖，金若敏,等.川楝子對大鼠肝毒性的時效和量效關(guān)系研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2008，40（7）:83

[11]Jusman SW,Halim A,Wanandi S I,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha（HIF-1 alpha） related to oxidative stress in liver of rat-induced by systemic chronic normobaric hypoxia[J].ActaMed Indones,2010,42（1）:17

[12]Oka T,Itoi T,Terada N,et al.Change in the membranous lipid composition accelerates lipid peroxidation in young rathearts subjected to2 weeksofhypoxia followed by hyperoxia[J].Circ J，2008,72（8）:1359