尹靜文 ，宋麗明 ，王杏林

（1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2.天津藥物研究院，釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津300193）

格列美脲鹽酸二甲雙胍復方片屬于固定劑量組成的復方制劑，目前國內(nèi)尚無上市品。臨床研究證實，鹽酸二甲雙胍與格列美脲聯(lián)合用藥能有效控制血糖，并能分別降低鹽酸二甲雙胍與格列美脲的毒副作用[1-5]。因此開發(fā)該復方制劑對提供一種療效確切、安全方便且副作用小的治療糖尿病的藥物顯得十分重要。現(xiàn)有的國家藥品標準[6-7]，《美國藥典》第34版[8]及文獻報道[9-10]中，僅有對鹽酸二甲雙胍或格列美脲單一成分的質(zhì)量控制方法。在格列美脲鹽酸二甲雙胍復方片有關物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，由于鹽酸二甲雙胍量占比例較大，其色譜峰拖尾嚴重；且除由原料中引入的雜質(zhì)外，還會產(chǎn)生一種特定雜質(zhì)（本文中稱為雜質(zhì)X）。經(jīng)試驗驗證，已有文獻方法均不適合格列美脲鹽酸二甲雙胍復方片中格列美脲雜質(zhì)的檢測。鑒于此，有必要對格列美脲鹽酸二甲雙胍復方片中有關物質(zhì)進行研究，以制定嚴格的質(zhì)量控制標準，保證新研發(fā)的復方制劑質(zhì)量的可控性，從而確保用藥安全。

1 材料與方法

1.1 儀器 安捷倫1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Thermo Fishier LCQAdvantage Max離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀，XS205型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），Anke TGL-16C離心機（上海安亭科學儀器廠），SK5200H超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司），F(xiàn)E20/EL20實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥 格列美脲對照品（批號：100674-200901中國藥品生物制品檢定所）；4-[2-[3-乙基-4-甲基-2-2氧-3-吡咯啉-1-甲酰氨基]乙基]苯磺酰胺基甲酸乙酯(命名為雜質(zhì)1，批號：100781-200901中國藥品生物制品檢定所)；4-[2-[3-乙基-4-甲基-2-2氧-3-吡咯啉-1-甲酰氨基]乙基]苯磺酰胺（命名為雜質(zhì)2，批號：100675-200901中國藥品生物制品檢定所）；格列美脲原料（含量：99.97%批號：GL2011021重慶賽維藥業(yè)有限公司）；格列美脲鹽酸二甲雙胍復方片（自制，規(guī)格：格列美脲1mg-鹽酸二甲雙胍 400mg，批號：GR-1，GR-2，GR-3）；乙腈（色譜純，天津市康科德色譜試劑公司）；氨水（分析純，天津市凱信化學工業(yè)有限公司）；磷酸二氫鈉（分析純，天津市岡船化學試劑科技有限公司）；純凈水（娃哈哈純凈水）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB C18column（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液為6.4mmol/L磷酸二氫鈉，用氨試液調(diào)pH至6.8，A相為乙腈-磷酸鹽緩沖液=35∶65，B相為乙腈-磷酸鹽緩沖液=65∶35，梯度洗脫條件見表1；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：228 nm；進樣量：20μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab1 Procedureof gradientelution by HPLC

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 格列美脲對照溶液：取格列美脲對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定容，配成濃度為0.2mg/mL的溶液。

1.3.2.2 雜質(zhì)貯備液：取雜質(zhì)1、雜質(zhì)2對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定容，配制成濃度均為0.2mg/mL的溶液。

1.3.2.3 雜質(zhì)對照溶液：精密量取雜質(zhì)貯備液，用乙腈稀釋200倍，配制成雜質(zhì)1、雜質(zhì)2濃度均為1μg/mL的溶液。

1.3.2.4 供試品溶液：取供試品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于格列美脲1mg），置離心管中，精密加入5mL乙腈，15～20℃水溫下，超聲，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

1.3.2.5 格列美脲自身對照溶液：取供試品溶液用乙腈稀釋200倍，配制成格列美脲濃度約為1μg/mL的溶液。

1.3.2.6 空白溶液：按處方量，取全輔料及鹽酸二甲雙胍粉末置離心管中，精密加入5mL乙腈，15～20℃水溫下，超聲，搖勻，離心，取上清液作為空白溶液。

1.3.3 系統(tǒng)適應性試驗 取供試品粉末適量（約相當于格列美脲10mg），加入25mL乙腈，15～20℃水溫下超聲，搖勻，離心，取上清液，60℃加熱放置1 h后，取5mL置10mL容量瓶中，另加入雜質(zhì)貯備液50μL，用乙腈稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適應性試驗溶液，按“1.3.1”項下方法測定，記錄色譜圖。

1.3.4 方法學實驗

1.3.4.1 強制降解試驗及溶液穩(wěn)定性試驗：取供試品粉末適量，按“1.3.2.4”項方法配制成供試品溶液。將供試品溶液經(jīng)以下條件處理：（1）酸：加0.1moL/L鹽酸溶液適量，搖勻，放置0.5 h，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液中和，離心，取上清液測定。（2）堿：加0.1moL/L氫氧化鈉溶液適量，搖勻，放置0.5 h，用0.1moL/L鹽酸溶液中和，離心，取上清液測定。（3）氧化：加30%雙氧水適量，搖勻，放置0.5 h，離心，取上清液測定。（4）光照：于4 000 Lx強度下照射3 h后測定。（5）加熱：于60℃烘箱中放置0.5 h、1 h后取出，放至室溫測定。（6）避光室溫下放置1 h、3 h后測定。（7）避光冷藏放置3 h后測定。

1.3.4.2 標準曲線繪制：精密移取“1.3.2.1”項下格列美脲對照溶液 20、30、40、50、60、80、100 μL，至10mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成格列美脲線性系列溶液。另精密移取“1.3.2.2”項下雜質(zhì)貯備液 20、30、40、50、60、80、100 μL，至 10mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成雜質(zhì)線性系列溶液，按“1.3.1”項方法測定，記錄色譜圖及峰面積。

1.3.4.3 定量限及最小檢出限試驗：分別將格列美脲對照溶液和雜質(zhì)貯備液稀釋，在上述色譜條件下，按信噪比（S/N）為10∶1計算定量限，按信噪比（S/N）為3∶1計算最小檢出限。

1.3.4.4 重復性試驗：取供試品粉末適量6份（約相當于格列美脲 1mg），照“1.3.2.4”和“1.3.2.5”項下方法分別平行配制格列美脲供試品溶液和自身對照溶液各6份，另取“1.3.2.3”項下雜質(zhì)對照溶液，按“1.3.1”項方法測定。按外標法計算已知雜質(zhì)含量，按自身對照法計算未知雜質(zhì)含量。

1.3.4.5 回收率試驗：取供試品粉末適量（約相當于格列美脲10mg），加入25mL乙腈，15～20℃水溫下超聲，搖勻，離心，取上清液作為供試品貯備液。分別移取“1.3.2.2”項下雜質(zhì)貯備液 40、50、60 μL 各3份到10mL量瓶中，分別加5mL供試品貯備液，用乙腈稀釋至刻度，作為回收率溶液；按“1.3.1”項法測定。按外標法計算。

1.3.5 供試品測定 取GR-1、GR-2、GR-3批供試品，照“1.3.2.4”和“1.3.2.5”項下方法分別配制格列美脲供試品溶液和自身對照溶液，另取“1.3.2.3”項下雜質(zhì)對照溶液，按“1.3.1”項下方法測定，按外標法計算已知雜質(zhì)含量，按自身對照法計算未知雜質(zhì)含量。

1.3.6 雜質(zhì)X歸屬研究 將強制降解試驗中熱破壞1 h供試品溶液進行HPLC-MS檢測，HPLC-MS條件為：流動相：0.1%醋酸緩沖液，用氨試液調(diào)pH至 4.0，A 相為乙腈-醋酸緩沖液=40∶60，B 相為乙腈-醋酸緩沖液=70∶30，梯度洗脫條件見表2；柱溫：30 ℃；流速：0.4mL/min；離子化模式：ESI，分析模式：正離子模式；毛細管溫度：250℃；噴霧電壓：4.5 KV，毛細管電壓：25 V；鞘氣流速：35 arb，輔助氣流速：20 arb。

表2 HPLC-MS梯度洗脫程序Tab2 Procedureof gradientelution by HPLC-MS

2 結果

2.1 系統(tǒng)適應性試驗 系統(tǒng)適應性試驗色譜圖見圖1，結果顯示，格列美脲、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)X分離度均大于2.0，按格列美脲峰計算理論塔板數(shù)不低于5 000，符合要求。

2.2 強制降解試驗及溶液穩(wěn)定性試驗 試驗結果見表3。結果表明，供試品溶液在酸、堿、氧化條件下基本穩(wěn)定，在加熱及長時間放置后雜質(zhì)2、雜質(zhì)X有較大程度增長。

表3 強制降解試驗及溶液穩(wěn)定性試驗結果Tab3 Forced degradation testing and solution stability testing results

2.3 標準曲線繪制 以峰面積A為縱坐標，以濃度C為橫坐標（μg/mL），繪制標準曲線，得到格列美脲、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2的線性回歸方程（n=7）：格列美脲：A=65 064 c+3 130.9 r=0.999 8 ；雜質(zhì) 1：A=85 937 c-1 988.9 r=0.999 7；雜質(zhì) 2：A=100 235 c-2 609.5 r=0.999 8。結果表明，格列美脲在0.41～2.22μg/mL，雜質(zhì)1在0.42～2.51μg/mL，雜質(zhì)2在0.45～2.04μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.4 定量限及最小檢出限試驗 格列美脲、雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的定量限分別為3.18、2.05和2.04 ng。格列美脲、雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的最小檢出限分別為0.955 、0.615 、0.612 ng。

2.5 重復性試驗 雜質(zhì)1未檢出；雜質(zhì)2含量為0.03%，RSD為0.55%；雜質(zhì)X含量為0.01%，RSD為0.31%；其它雜質(zhì)總和為0.19%，RSD為0.41%。符合藥典規(guī)定，重復性良好。

2.6 回收率試驗 雜質(zhì)1、雜質(zhì)2回收率分別為99.75%和99.81%，RSD分別為0.43%和0.61%（n=9）。

2.7 供試品測定 測定結果見表4。

表4 供試品與格列美脲原料中格列美脲有關物質(zhì)檢查結果Tab4 Testing results for related substance

2.8 雜質(zhì)X歸屬研究 格列美脲和雜質(zhì)X的HPLC-MS圖見圖2。格列美脲分子量為491.04，雜質(zhì)X分子量為422.89。

3 討論

提取溶劑及提取條件的選擇：格列美脲在乙腈中溶解性較好，在水中溶解性差，而鹽酸二甲雙胍在水中易溶，在乙腈中溶解性較差，為減少鹽酸二甲雙胍對測定的干擾，選擇乙腈作為提取溶劑。經(jīng)試驗驗證，乙腈作為溶劑，不干擾測定。由于格列美脲對熱不穩(wěn)定，故需控制超聲溫度，經(jīng)試驗驗證，超聲溫度在15～20℃條件下，可控制雜質(zhì)增長。

流動相的選擇：根據(jù)《美國藥典》（第34版）[8]格列美脲有關物質(zhì)檢測方法，流動相為6.4mmol/L磷酸二氫鈉，用稀磷酸調(diào)pH至2.5～3.0，乙腈-磷酸鹽緩沖液=50∶50。按該條件測定，格列美脲、雜質(zhì)1和雜質(zhì)2保留時間分別為28.12min、5.35min和4.16 min，但本復方制劑中由于鹽酸二甲雙胍量過大，色譜峰拖尾嚴重，保留時間為0～3.4min，且試驗中發(fā)現(xiàn)，本復方制劑的新增雜質(zhì)X，保留時間為3.68min，與雜質(zhì)2無法達到基線分離，干擾雜質(zhì)2的測定。故考慮通過改變緩沖液pH值和流動相比例，解決上述問題。通過試驗發(fā)現(xiàn)：當緩沖液pH值調(diào)整至6.0～7.0 時，雜質(zhì) 2 保留時間為 8.25～8.35min，雜質(zhì)X保留時間為3.78～3.85min，雜質(zhì)X與雜質(zhì)2分離良好；當pH=6.8時，主峰對稱性最好。當緩沖液pH=6.8，比例提高到65%時，雜質(zhì)X保留時間為4.88min，雜質(zhì)2保留時間為10.54min，鹽酸二甲雙胍及輔料峰保留時間為0～3.58min，三者達到良好分離。但該條件下，格列美脲保留時間過長，通過試驗發(fā)現(xiàn)，隨乙腈比例增加，主峰出峰時間明顯縮短，當乙腈比例大于60%時，主峰出峰時間較適宜。因此考慮采用梯度洗脫方法解決此問題。經(jīng)試驗驗證在“1.3.1”項色譜條件下，各雜質(zhì)峰均能達到良好分離，主峰出峰時間適宜，雜質(zhì)洗脫完全。

雜質(zhì)X歸屬研究：復方制劑中新生雜質(zhì)的來源可能為：（1）原料之間相互作用。（2）原輔料間相互作用。（3）制劑工藝及儲存過程引發(fā)的降解產(chǎn)物。要對新生雜質(zhì)進行歸屬和限度測定，需進行原料相容性試驗、原輔料相容性試驗、制劑工藝考察和穩(wěn)定性考察[11]。本試驗中分別按處方量將格列美脲原料藥、格列美脲和鹽酸二甲雙胍原料混合物、格列美脲與輔料、供試品（GR1，GR2，GR3）放置于高溫、高濕、強光下考察。結果發(fā)現(xiàn)，格列美脲與鹽酸二甲雙胍原料混合物，在高溫條件下不穩(wěn)定，除雜質(zhì)2外，新增雜質(zhì)X約為1.0%。而供試品在高溫條件下放置后，雜質(zhì)X增長遠小于原料混合物。推測雜質(zhì)X可能由格列美脲和鹽酸二甲雙胍原料間相互作用而產(chǎn)生，當通過制劑工藝減少兩種原料的直接接觸后，雜質(zhì)X增長很小。根據(jù)HPLC/MS一級質(zhì)譜檢測的分子離子峰及碎片信息（圖2），雜質(zhì)X分子量為423。格列美脲酰胺鍵易斷裂，斷裂后分子量為352,而鹽酸二甲雙胍胍基易與其它部分斷裂[12]，胍基斷裂后剩余部分分子量為71，由此進一步推測雜質(zhì)X可能為格列美脲與鹽酸二甲雙胍原料相互作用結果。

綜上所述，采用該色譜條件，復方制劑中各雜質(zhì)均能有效分離，可用于復方格列美脲鹽酸二甲雙胍片中格列美脲有關物質(zhì)，特別是雜質(zhì)X，雜質(zhì)2的控制。通過HPLC-MC檢測，推測雜質(zhì)X可能為格列美脲與鹽酸二甲雙胍原料相互作用的產(chǎn)物。

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