劉 佳，秦 楠，牛文彥，段宏泉

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，天津300070）

目前世界上糖尿病患病人數(shù)已高達(dá)2億5千萬人，每年新發(fā)病6百萬人，其中90%以上是2型糖尿病(T2DM)。2型糖尿病是由于胰島素分泌減少，胰島素作用缺陷以及靶組織（主要是肌肉和肝臟）的胰島素抵抗引起的。骨骼肌攝取葡萄糖主要由跨膜蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（glucosetransporter4-GLUT4）完成，骨骼肌細(xì)胞膜上的GLUT4的數(shù)量決定葡萄糖攝取量[1-2]。本課題組通過對抗糖尿病活性成分委陵菜黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到了一系列黃酮類衍生物，報(bào)道了該類黃酮衍生物能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量[3-4]。本文旨在評(píng)價(jià)黃酮衍生物對不同的糖尿病相關(guān)靶組織的作用，選擇了大鼠骨骼肌細(xì)胞（L6）并通過類ELISA法測定L6細(xì)胞膜上GLUT4的量，以評(píng)價(jià)黃酮衍生物對骨骼肌葡萄糖利用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 L6GLUT4myc細(xì)胞株由加拿大Amira Klip教授惠贈(zèng)；α-MEM（天潤善達(dá)公司）；胰酶（天潤善達(dá)公司），D-Hanks液配制；Hanks液（天潤善達(dá)公司）；胎牛血清（以色列STERILE）；抗myc單克隆抗體（9E10，Sigma公司）；偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體（Jackson Immuno Research）；胰島素（Sigma公司）。

1.1.2 黃酮衍生物1~14的化學(xué)結(jié)構(gòu) 圖示化合物均用DMSO溶解成濃度為10mg/mL的貯存液，實(shí)驗(yàn)前用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基分別稀釋，配制成濃度分別為10μg/mL和5μg/mL的樣品溶液。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃，含5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待接種于培養(yǎng)板中的細(xì)胞密度達(dá)100%時(shí)，再用含1%胎牛血清的培養(yǎng)基分化為成肌細(xì)胞，每兩天換1次分化液，于接種后第8天用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 類ELISA法測定細(xì)胞膜上L6GLUT4myc 在分化后的L6 GLUT4myc培養(yǎng)板中加入黃酮衍生物稀釋液每孔1mL（留空白孔、背景孔和胰島素孔），24 h后無血清培養(yǎng)3 h[5]，加入100 nmol/L的胰島素，20min后將培養(yǎng)板置于冰上；用預(yù)冷的含1mmol/L Ca2+和1mmol/LMg2+的PBS(+)溶液洗 3次，用 5%(v/v)山羊血清封閉肌管，10min后用抗myc單克隆抗體（1∶500稀釋）搖床上冰浴孵育 1 h；PBS（+）洗6次，用含4%的多聚甲醛冰上固定肌管10min，室溫固定20min，再用0.1mol/L的甘氨酸冰上淬滅10min，用偶聯(lián)過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG（1∶1 000稀釋）室溫孵育 40min；PBS（+）沖洗 6次，加入底物鄰苯二胺溶液，20 min后用0.20 mL的3 mol/L HCl溶液終止，490 nm測定上清液吸光度值。計(jì)算公式如下：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，對所得數(shù)據(jù)采用表示，兩兩比較采用students t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃酮衍生物1~14對L6 GLUT4myc轉(zhuǎn)位的影響 本研究應(yīng)用抗myc的抗體可在保持細(xì)胞膜完整的狀態(tài)下測定轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上的GLUT4量。結(jié)果如圖1所示，相對于對照組，胰島素刺激組中GLUT4的量明顯上升為對照組的（2.71±0.06）倍（P<0.05），各黃酮衍生物組 1、5、6、8~11在濃度為 10μg/mL時(shí)，GLUT4的量分別為對照組的（3.60±0.30）倍、（3.66±0.26）倍、（2.87±0.49）倍、（3.97±0.37）倍、（2.82±0.45）倍、（3.37±0.67）倍、（4.43±0.61）倍（P值均小于0.05），對L6 GLUT4myc細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位顯示了明顯地促進(jìn)作用。

2.2 與胰島素疊加作用結(jié)果 黃酮衍生物6與胰島素疊加作用結(jié)果如圖2所示，相對于對照組，胰島素組、衍生物6組、衍生物6+胰島素組的GLUT4量明顯上升，GLUT4量分別為對照組的(2.71± 0.06)倍、（2.67±0.19）倍、（4.31±0.22）倍（P 值均小于0.05）。結(jié)果表明衍生物6不僅促進(jìn)L6細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)位，并且與胰島素具有協(xié)同作用。

3 討論

帶有myc表位標(biāo)記的L6GLUT4myc細(xì)胞的GLUT4myc表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過內(nèi)源性的GLUT4，無論是基礎(chǔ)狀態(tài)下還是胰島素刺激狀態(tài)下的葡萄糖吸收都是由GLUT4myc轉(zhuǎn)運(yùn)的[6]。因此，根據(jù)細(xì)胞膜上GLUT4myc數(shù)量變化可以推測細(xì)胞攝取葡萄糖量的變化。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，委陵菜黃酮衍生物1、5、6、8~11在 10μg/mL作 用 濃 度 下 顯 著 增加L6GLUT4myc大鼠骨骼肌細(xì)胞膜表面GLUT4myc的水平，即刺激GLUT4myc的轉(zhuǎn)位。與胰島素疊加作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮衍生物6與胰島素具有協(xié)同作用。

雖然文獻(xiàn)報(bào)道了大量黃酮類化合物的抗糖尿病活性，包括在脂肪細(xì)胞（3T3-L1）[7]和肝細(xì)胞（HepG2）以及糖尿病模型動(dòng)物中的抗糖尿病作用[8-9]，但在骨骼肌細(xì)胞（C2C12）中的研究僅有1篇報(bào)道了橘皮素在100μmol濃度下促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)位作用[10]。本文首次報(bào)道了黃酮衍生物在20~30μmol濃度下顯著促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞L6GLUT4的轉(zhuǎn)位，并與胰島素存在協(xié)同作用，有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

[1]Klip A.Themany ways to regulate glucose transporter 4[J].Appl PhysiolNutrMetab,2009,34（3）:481

[2]Jessen N,Goodear L J.Contraction signaling to glucose transport in skeletalmuscle[J].JApplPhysiol,2005,99（1）:330

[3]Zhu Y,Zhang Y,Liu Y,et al.Synthesis and biological activity of trans-tilioside derivatives as potent anti-diabetic agents[J].Molecules,2010,15（12）:9174

[4]Qin N,Li C B,Jin M N,et al.Synthesis and biological activity of novel tilirosidederivants[J].Eur JMed Chem,2011,46（10）:5189

[5]Kundu JK,Surh Y J.Inflammation:Gearing the journey to cancer[J].MutatRes,2008,659（1/2）:15

[6]NiuW,Bilan PJ,Ishikura S,etal.Contraction-related stimuliregulateGLUT4 traffic in C2C12-GLUT4myc skeletalmuscle cells[J].Am JPhysiolEndocrinolMetab,2010,298（5）:E1058

[7]Thyagarajan-Sahu A,Lane B,Sliva D.ReishiMax,mushroom based dietary supplement,inhibits adipocyte differentiation,stimulates glucoseuptakeandactivatesAMPK[J].BMCComplementAlternMed,2011,11（9）:74

[8]Li Y,Xu S,Mihaylova M M,etal.AMPK phosphorylates and inhibits SREBPactivity toattenuatehepatic steatosisand atherosclerosis in diet-induced insulin resistantmice[J].CellMetab,2011,13（4）:376

[9]ZhangW Y,Lee JJ,Kim IS,etal.7-O-methylaromadendrin stimulates glucose uptake and improves insulin resistance in vitro[J].BiolPharm Bull,2010,33（9）:1494

[10]Kim M S,Hur H J,Kwon D Y,etal.Tangeretin stimulates glucose uptake via regulation of AMPK signaling pathways in C2C12 myotubes and improves glucose tolerance in high-fat diet-induced obesemice[J].MolCellEndocrinol,2012,358（1）:127