周曉磊，尤勝義

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科，天津 300052）

柴胡疏肝散出自《景岳全書》，主治肝郁氣滯證，方中用柴胡疏肝解郁為君藥。香附理氣疏肝，同時可行氣活血而止痛，助柴胡以解開經(jīng)之郁滯，為臣藥。陳皮、枳殼理氣行滯；芍藥、甘草養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，為佐藥。甘草兼調(diào)諸藥，亦為使藥之用。諸藥相合，發(fā)揮疏肝解郁、理氣止痛功效。慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的中醫(yī)辨證主要表現(xiàn)為肝郁氣滯為主的實熱或濕熱郁結(jié)，因此臨床上應(yīng)用柴胡疏肝散治療CP取得了較好療效，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其治療機制可能與抗炎、保肝、清除氧自由基及改善微循環(huán)等作用有關(guān)。糖代謝障礙作為CP的主要并發(fā)癥之一，近年來開始受到各國學(xué)者的關(guān)注。由于發(fā)病機制不清，控制CP患者的血糖成為一項世界性難題。深入研究發(fā)現(xiàn)CP患者及動物模型存在明顯的肝臟胰島素抵抗，即胰島素抑制肝臟糖異生和糖原分解的作用減弱，是導(dǎo)致機體糖代謝障礙的重要致病因素[1]。本研究旨在觀察中藥柴胡疏肝散對CP引發(fā)的大鼠肝臟胰島素抵抗的干預(yù)作用，并探討其機制，為臨床治療CP患者糖代謝障礙提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雌性Wistar大鼠40只，體重180～250 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心(許可證編號SCXK津2005-0001)，12 h日光燈照射維持晝夜循環(huán)。

1.2 主要試劑 99%油酸購自美國Sigma公司；柴胡疏肝散（柴胡6 g、陳皮6 g、川芎4.5 g、香附4.5 g、枳殼4.5 g、芍藥4.5 g、炙甘草1.5 g）由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑室煎制成濃度0.56 g/mL的水煎劑；核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）p65兔抗大鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國Bioworld公司；SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。

1.3 動物分組及干預(yù) 大鼠隨機分為模型組、對照組、中藥低劑量治療組和高劑量治療組，每組10只。模型組和兩治療組大鼠采用油酸胰膽管注射的方法建立CP模型，切取胰腺組織行病理學(xué)檢查確證模型成功[2-3]；對照組僅打開腹腔輕度翻轉(zhuǎn)胰腺后關(guān)腹。6周后低劑量和高劑量組大鼠，分別每日每只給予柴胡疏肝散水煎劑1.4 g/kg和2.8 g/kg體重灌胃，模型組與對照組大鼠給予等量蒸餾水灌胃，共4周。整個實驗持續(xù)10周。

1.4 口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test,OGTT） 給藥后4周，大鼠禁食16 h，按2 g/kg劑量將預(yù)先配制好的1.11mmol/L無菌葡萄糖溶液灌胃，尾靜脈取血，微量血糖儀測定各組大鼠0、30、60、120min和180min血糖值，根據(jù)公式計算OGTT曲線下血糖面積（areaunder curve,AUC）[4]，AUC 越大代表糖耐量受損越嚴重。

1.5 胰島素耐量實驗（insulin tolerance test,ITT） 給藥后4周，各組大鼠按0.75 IU/kg的人胰島素注射，于注射后0、30、60、120min尾靜脈取血微量血糖儀測定血糖，根據(jù)公式計算胰島素刺激下的葡萄糖下降率 （glucose disappearance rate,KITT）[5]，KITT值降低提示胰島素敏感性降低。

1.6 肝細胞分離和葡萄糖釋放實驗 兩步膠原酶灌注法分離肝細胞[6-8]，臺盼藍排斥實驗評估肝細胞活力。將分離獲得的肝細胞用含5mmol/L乳酸鈉和0.5mmol/L丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基調(diào)成1×106個細胞/mL的細胞懸液。培養(yǎng)基中不加胰島素的作為基礎(chǔ)組，其余加入1nmol/L胰島素的作為胰島素組。然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，吸取上清液利用全自動生化分析儀測定葡萄糖濃度，同批次內(nèi)重復(fù)測定3次。離心管中剩余部分BCA法進行蛋白定量。最后將葡萄糖濃度用蛋白濃度進行標(biāo)準(zhǔn)化，用μmol/（g蛋白·h）表示。

1.7 免疫組化法檢測肝臟NF-κB活化水平 利用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)法檢測肝臟NF-κB p65活性。結(jié)果判定：細胞染色呈棕黃色為陽性，定位于細胞核和細胞漿。陽性率計算方法：取5個高倍視野計算陽性細胞占總細胞數(shù)的百分率作為陽性率。

1.8 統(tǒng)計處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料均以表示，多個樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析（oneway ANOVA），均數(shù)間兩兩比較用LSD檢驗。以P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 AUC值 將OGTT實驗血糖值按公式計算AUC值，結(jié)果顯示：模型組AUC值顯著高于對照組（P<0.05)，兩個治療組與模型組比較AUC值均顯著降低（P<0.05)，而高劑量組AUC值顯著低于低劑量組（P<0.05）。各組AUC值結(jié)果見表1。

2.2 KITT值 將ITT實驗血糖值按公式計算KITT值，結(jié)果顯示：模型組KITT值顯著低于對照組（P<0.05），兩個治療組與模型組比較KITT值均顯著升高（P<0.05)，而兩治療組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組KITT值結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠AUC和KITT結(jié)果Tab 1 AUC and K ITT value in each group

表1 各組大鼠AUC和KITT結(jié)果Tab 1 AUC and K ITT value in each group

與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與低劑量組比較△P<0.05

組別對照組模型組低劑量組高劑量組KITT/(%/min)8.36±1.66 2.34±0.91*5.78±1.85*#7.36±2.00#AUC/[mmol/(L·h)]13.86±1.18 23.25±2.74*19.35±1.51*#16.12±1.53#△n 10 10 10 10

2.3 肝細胞葡萄糖釋放濃度 在基礎(chǔ)條件下各組大鼠離體肝細胞的葡萄糖釋放濃度之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；在培養(yǎng)基含1 nmol/L胰島素的條件下，各組大鼠肝細胞的葡萄糖釋放與其在基礎(chǔ)條件下比較出現(xiàn)不同程度降低，其中對照組下降最明顯。各組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度檢測結(jié)果見表2。

表2 各組肝細胞培養(yǎng)基葡萄糖檢測結(jié)果Tab 2 Glucose concentrations inm edium of isolated hepatocyte from each group

表2 各組肝細胞培養(yǎng)基葡萄糖檢測結(jié)果Tab 2 Glucose concentrations inm edium of isolated hepatocyte from each group

與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05

對照組模型組低劑量組高劑量組10 10 10 10胰島素組23.06±5.67 45.11±12.03*32.90±11.20#28.97±10.80#基礎(chǔ)組86.64±12.21 87.15±16.27 82.47±15.30 80.31±12.40葡萄糖[μmol/(g蛋白·h)]抑制率/%(基礎(chǔ)組-胰島素組)/基礎(chǔ)組×100%73.57±4.28 48.49±7.95*60.11±9.26*#63.93±8.21*#組別 n

2.4 免疫組化結(jié)果 對照組絕大多數(shù)細胞無明顯染色，極少數(shù)細胞有一定程度染色，主要在胞漿,見圖1A；模型組絕大多數(shù)細胞有強染色，且染色主要集中在胞核,見圖1B；兩個治療組有中等數(shù)量的細胞染色呈陽性，胞漿和胞核均有一定程度著色，其中高劑量組的陽性細胞數(shù)較低劑量組更少，見圖1C和1D。各組大鼠肝臟NF-κB陽性細胞率見表3。

圖1 各組肝臟NF-κB免疫組化圖（×200）Fig 1 Imm unohistochem istry for hepatic NF-κB expression in each group（×200）

表3 肝臟NF-κB陽性細胞率Tab 3 Percentageof NF-κB-positive staining cells in hepatic cells

表3 肝臟NF-κB陽性細胞率Tab 3 Percentageof NF-κB-positive staining cells in hepatic cells

與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05；與低劑量組比較△P<0.05

n 10 10 10 10組 別對照組模型組低劑量組高劑量組NF-κB陽性細胞/%9.648±2.844 80.413±18.096*53.933±10.911*#42.313±9.295*#△

3 討論

隨著我國人民生活水平提高和飲食結(jié)構(gòu)改變，CP發(fā)病率逐年增加。文獻報道約1/3的CP患者繼發(fā)糖尿病，70%以上的患者存在糖耐量異常[9]，因此深入研究CP糖代謝障礙的發(fā)生機制、探索有效治療藥物對于改善患者的預(yù)后具有重要意義。肝臟內(nèi)生性糖的產(chǎn)生(hepatic glucose production,HGP)包括糖異生和糖原分解，受血清胰島素負性調(diào)節(jié)，維持機體正常的血糖水平[10-12]。國外有學(xué)者給CP患者輸注同位素標(biāo)記的葡萄糖后，利用正常血糖-高胰島素鉗夾技術(shù)檢測HGP，結(jié)果表明CP病理狀態(tài)下胰島素抑制HGP的能力減弱，即發(fā)生了肝臟胰島素抵抗[13]，這一發(fā)現(xiàn)使研究人員開始關(guān)注肝臟胰島素抵抗在CP糖代謝障礙中的致病作用。本實驗中，ITT結(jié)果顯示模型組大鼠KITT值顯著低于對照組 (P<0.05)，提示CP導(dǎo)致大鼠胰島素敏感性降低，即發(fā)生胰島素抵抗；同時大鼠肝細胞離體實驗結(jié)果顯示在培養(yǎng)基含1 nmol/L胰島素的條件下，雖然各組大鼠肝細胞的葡萄糖釋放均受到不同程度地抑制，但模型組的抑制率僅為48.49%，與對照組73.57%的抑制率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這一結(jié)果提示CP大鼠肝細胞對胰島素的敏感性減低，與上述ITT活體實驗結(jié)果一致，進一步證明肝臟胰島素抵抗是CP導(dǎo)致機體發(fā)生糖代謝障礙的一個重要機制。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為CP的病因多為長期嗜酒、飲食不節(jié)、情志不暢，致使肝膽脾胃功能失調(diào)，而表現(xiàn)為肝郁氣滯，脾胃濕熱蘊結(jié)為主的實熱或濕熱郁結(jié)。胰腺炎癥反復(fù)發(fā)作，久之肝胃郁熱，火炎于上，津液泄于下；肝之疏泄太過，腎之閉藏失司，則糖尿病“三多一少”癥狀隨之而起。柴胡疏肝散源于明·張介賓《景岳全書》，是在《傷寒論》四逆湯的基礎(chǔ)上去枳實加枳殼、陳皮、川芎、香附而成，具有疏肝解郁、理氣止痛功效，臨床常用于治療肝氣郁結(jié)證。本實驗應(yīng)用柴胡疏肝散治療4周后，OGTT顯示兩個治療組與模型組比較AUC值均顯著降低（P<0.05），而高劑量組AUC值顯著低于低劑量組（P<0.05），說明應(yīng)用柴胡疏肝散治療CP大鼠的糖耐量異常療效確切，而且呈一定劑量依賴性。ITT和肝細胞釋放實驗結(jié)果顯示兩治療組較模型組大鼠的KITT值和胰島素對離體肝細胞葡萄糖釋放的抑制率均顯著升高（P<0.05），說明柴胡疏肝散治療CP糖代謝障礙與改善肝臟胰島素抵抗有關(guān)。

目前普遍認為胰島素抵抗是一種慢性非特異性炎癥過程，受NF-κB活性調(diào)控的許多炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α、白介素-1β等均能誘發(fā)胰島素抵抗。國內(nèi)外研究均已證實下調(diào)NF-κB的活性能使肝臟和脂肪等組織的胰島素敏感性增加，而上調(diào)NF-κB的活性能誘導(dǎo)這些組織發(fā)生胰島素抵抗[14-15]。我們在以往的研究中應(yīng)用Western blot檢測了CP大鼠肝臟的NF-κBp65蛋白表達，結(jié)果顯示模型組肝組織NF-κBp65蛋白表達較對照組明顯升高（P<0.05）[16]。而本實驗中肝臟免疫組化的結(jié)果顯示模型組肝臟NF-κBp65陽性細胞率較對照組顯著增高（P<0.05），與 Western blot結(jié)果一致，說明上調(diào)肝臟NF-κB活性可能是CP引發(fā)肝臟胰島素抵抗的機制之一。此外，兩治療組肝臟NF-κBp65陽性細胞率較模型組均顯著降低（P<0.05），表明柴胡疏肝散通過抑制肝臟NF-κB的過度活化，進而改善CP引發(fā)的肝臟胰島素抵抗，治療糖代謝障礙。本實驗豐富了中西醫(yī)結(jié)合學(xué)科的內(nèi)涵，為探索新型的針對CP患者的降糖藥物開拓了新思路，對于改善CP患者的預(yù)后具有潛在應(yīng)用價值。

[1]Andersen D K.Mechanisms and emerging treatments of the metabolic complicationsof chronic pancreatitis[J].Pancreas,2007,35(1):1

[2]趙戰(zhàn)朝，孫紹梅，梁泉，等.油酸誘導(dǎo)的慢性胰腺炎大鼠繼發(fā)胰源性糖尿病模型的建立[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，13(2):171

[3]梁泉，薛承銳，費乃昕，等.羅格列酮對油酸誘導(dǎo)的慢性胰腺炎大鼠肝臟細胞IR及IRS-1表達的調(diào)節(jié)[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,13(2):177

[4]Rac hoń D,Vortherms T,Seidlová-Wuttke D,etal.Effectsof black cohosh extracton bodyweightgain,intra-abdominal fataccumulation,plasma lipids and glucose tolerance in ovariectomized Sprague-Dawley rats[J].Maturitas,2008,60(3/4):209

[5]Kim JK,Kim Y J,Fillmore JJ,etal.Prevention of fat-induced insulin resistanceby salicylate[J].JClin Invest,2001,108(3):437

[6]EisenbergM L,Maker A V,Slezak LA,etal.Insulin receptor(IR)and glucose transporter2(GLUT2)proteins form a complex on the ra thepatocytemembrane[J].CellPhysiolBiochem,2005,15(1/4):51

[7]Heinzinger H,van den Boom F,Tinel H,et al.In rat hepatocytes,thehypertonic activation ofNa(+)conductanceand Na(+)-K(+)-2Cl(-)symport--butnot Na(+)-H(+)antiport--ismediated by protein kinase C[J].JPhysiol,2001,536(Pt3):703

[8]楊友生，瞿祥春，李樹生.瘦素對培養(yǎng)大鼠原代肝細胞葡萄糖吸收及肝細胞膜胰島素受體磷酸化的影響[J].內(nèi)科急危重癥雜志，2008，14(4):178

[9]Vlasakova Z,Bartos V,Spicak J.Diabetesmellitus in chronic pancreatitisand insulin sensitivity[J].Vnitr Lek,2002,48(9):878

[10]Escribano O,Guillén C,Neva do C,etal.Beta-cell hyperplasia induced by hepatic insulin resistance:role of a liver-pancreatic endocrine axis through insulin receptor a isoform[J].Diabetes,2009,58(4):820

[11]Serfaty L,Capeau J,Hepatitis C,et al.Insulin resistance and diabetes:clinicaland pathogenic data[J].Liver Int,2009,29(Suppl2):13

[12]Fisher SJ,Kahn CR.Insulin signaling is required for insulin’s directand indirectaction on hepatic glucose production[J].JClin Invest,2003,111(4):463

[13]BrunicardiFC,Chaiken R L,Ryan A S,etal.Pancreatic polypeptide administration improves abnormal glucosemetabolism in patientswith chronic pancreatitis[J].JClin EndocrinolMetab,1996,81(10):3566

[14]Gao Z,Yin J,Zhang J,etal.Inactivation ofNF-kappaB p50 leads to insulin sensitization in liver through post-translational inhibition of p70S6K[J].JBiolChem,2009,284(27):18368

[15]易屏，陸付耳，陳廣，等.游離脂肪酸刺激核因子NF-κBp65核轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的分子機制[J].世界華人消化雜志,2007,15(15):1706

[16]張鵬，趙戰(zhàn)朝，梁泉，等.慢性胰腺炎大鼠肝組織NF-κB的表達及中藥的干預(yù)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2008，14(5):490