陳招娣，李潤成*，蔣大良，余興龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)引起，以母豬特別是初產(chǎn)母豬繁殖障礙為特征的一種病毒性疾病。該病能導(dǎo)致母豬不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、畸胎或死胎、新生仔豬死亡，還能導(dǎo)致仔豬皮炎、腹瀉等。

2011年4月，湖南某規(guī)模豬場飼養(yǎng)的160頭母豬中60頭初產(chǎn)母豬，陸續(xù)表現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，木乃伊胎等。筆者對該場的母豬抽樣采血并進行了豬瘟病毒抗體、藍(lán)耳病毒抗體以及偽狂犬的野毒抗體的檢測。此外還對流產(chǎn)死胎進行了豬細(xì)小病毒的病原學(xué)檢測?，F(xiàn)報告如下：

1 材料

1.1 病料樣品

21 份母豬血液（1～10 號來自經(jīng)產(chǎn)母豬、11～21號來自初產(chǎn)母豬），3頭懷孕70天以內(nèi)流產(chǎn)的死胎。

1.2 主要試劑和試劑盒

檢測豬瘟病毒抗體、藍(lán)耳病毒抗體、偽狂犬野毒抗體的ELISA 試劑盒均為美國IDEXX 公司生產(chǎn)，PCR 試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠為鼎國公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 血清抗體的檢測 按試劑盒操作說明進行。

2.2 細(xì)小病毒的PCR 檢測

?

2.2.1 引物的設(shè)計和合成

參照GeneBank 上登陸的豬細(xì)小病毒基因序列(參考序列登陸號為EU790641)，設(shè)計一對引物，特異性擴增196bp 的DNA 片段。引物設(shè)計見表1。

2.2.2 PCR 檢測

取流產(chǎn)死胎的肝臟、肺臟，研磨成勻漿，按蛋白酶K、酚、氯仿的方法抽提，提取基因組后，用引物Fp1 和Rpl 進行PCR 擴增豬細(xì)小病毒特異性片段，PCR 反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；進入循環(huán)，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30s，進行 35 個循環(huán)；72℃延伸7min。最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.2.3 PCR 產(chǎn)物測序

將PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒進行清潔純化，純化后的PCR 擴增產(chǎn)物送北京華大生物技術(shù)有限公司進行測序并將測出的序列進行Blast 分析確定。

3 結(jié)果

3.1 血清抗體檢測結(jié)果

取21 份母豬血清分別進行豬瘟病毒抗體（HCV Ab）、藍(lán)耳病毒抗體（PRRSV Ab）、偽狂犬野毒抗體（PRV Ab）3 個項目的檢測。檢測結(jié)果見表2，由表2 可見21 份血清中有14 份為豬瘟抗體陽性，其中經(jīng)產(chǎn)母豬的有7 份，初產(chǎn)母豬的有7 份；藍(lán)耳病毒抗體則所有樣本均為陽性，21 份樣本中S/P 值均在2.0 以下；所有血清樣品偽狂犬野毒抗體均為陰性。

表2 中，豬瘟抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：阻斷率≥40%為陽性（+），阻斷率≤30%為陰性（-），30% ＜ 阻斷率＜40%為可疑（±）；藍(lán)耳病毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P值≥0.4 時為陽性（+），S/P 值 ＜0.4 時為陰性（-）；偽狂犬野毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：被檢樣品S/N≤0.6 為抗體陽性（+）；S/N＞0.7 為抗體陰性（-）；0.6＜S/N≤0.7 為可疑（±）。

?

3.2 PCR 檢測結(jié)果

以提取的豬細(xì)小病毒基因組為模板，用設(shè)計的豬細(xì)小病毒特異性引物進行PCR 擴增，結(jié)果見圖1，由圖可見3 份病料樣本均擴增出與預(yù)期大小相符的片段。

3.3 測序結(jié)果

PCR 產(chǎn)物純化后送公司進行1 個反應(yīng)的測序，共得到196bp 的準(zhǔn)確序列，進行BLAST 分析發(fā)現(xiàn)該病毒確為豬細(xì)小病毒，序列如下：

GGACCATTAACAGCACTAAACAATACTGCACCTG TATTTCCAAATGGTCAAATATGGGATAAAGAACT TGATACAGATCTAAAACCTAGACTACATGTTACA GCTCCATTTGTTTGTAAAAACAATCCACCAGGAC AACTATTTGTAAAAATAGCACCAAACCTAACAG ATGATTTCAATGCTGACTCTCCTCAAC

4 討論

4.1 疫情診斷

該母豬群豬瘟抗體陽性率66.67%，陰性率28.57%，可疑率4.76%；藍(lán)耳病毒抗體陽性率為100%，且抗體水平S/P 值均在0.4～2.0 之間；偽狂犬野毒抗體均為陰性。從檢測結(jié)果可見該母豬群豬瘟抗體水平不理想，但由于表現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎的初產(chǎn)母豬有半數(shù)以上豬瘟抗體水平較好，抗體阻斷率值在60%以上，因此可以推斷該次疫情不是由豬瘟病毒引起，此外，母豬群藍(lán)耳病毒抗體均為陽性且抗體水平比較整齊，目前該豬場應(yīng)該不屬于藍(lán)耳病毒感染活躍豬群；偽狂犬野毒抗體均為陰性，表明豬群中沒有偽狂犬野毒感染和流行。

取流產(chǎn)死胎進行豬細(xì)小病毒的PCR 檢測并測序，結(jié)果表明在樣本中均能檢測到細(xì)小病毒基因，結(jié)合臨床癥狀可將該場出現(xiàn)的初產(chǎn)母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎確診為細(xì)小病毒感染造成。

4.2 豬場細(xì)小病毒病的防控

豬細(xì)小病毒病是導(dǎo)致母豬特別是初產(chǎn)母豬繁殖障礙的疾病之一，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，母豬的健康和產(chǎn)仔率、仔豬成活率越來越成為養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)鍵。筆者認(rèn)為，對于豬細(xì)小病毒病的防控應(yīng)做到以下幾點：一是引種要規(guī)范，杜絕引進病豬和帶毒豬；二是初產(chǎn)母豬要主動免疫后才能配種，后備公豬在配種前一個月應(yīng)進行免疫接種；三是要建立規(guī)范、科學(xué)的免疫程序，定期進行血清學(xué)監(jiān)測及時了解豬群免疫狀況；四是應(yīng)建立高標(biāo)準(zhǔn)的衛(wèi)生防疫和綜合防制措施，杜絕病毒的傳播和污染，促進豬場健康發(fā)展。 □