耿青青

運(yùn)動(dòng)免疫學(xué)研究已證實(shí)，運(yùn)動(dòng)員長期從事大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的運(yùn)動(dòng)性免疫失衡現(xiàn)象?，F(xiàn)有研究多從外周免疫細(xì)胞的失衡、失調(diào)入手探討機(jī)理，本研究結(jié)合課題組前期研究成果［1-6］，推斷雖然這些現(xiàn)象出現(xiàn)在血液，但根源可能在淋巴細(xì)胞的發(fā)生源頭骨髓，即運(yùn)動(dòng)應(yīng)激通過影響骨髓造血微環(huán)境中各種調(diào)控因子進(jìn)而影響了淋巴細(xì)胞的發(fā)育異常。

B細(xì)胞發(fā)育過程中有許多特征性的基因表達(dá)，這些特定基因的表達(dá)是由眾多的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的。轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)不同譜系特異基因的表達(dá)，保證發(fā)育分化過程中向某一譜系分化時(shí)失去向其他譜系分化的潛能。影響B(tài)細(xì)胞早期發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)節(jié)著2個(gè)關(guān)卡，即共同淋巴樣祖細(xì)胞向B細(xì)胞譜系發(fā)育和祖B細(xì)胞向前B細(xì)胞發(fā)育。目前已知PU.1和Ikaros在第一個(gè)關(guān)卡起作用，而E2A、EBF和BSAP／PAX5可能在第二個(gè)關(guān)卡起作用，這些轉(zhuǎn)錄因子的等級(jí)性調(diào)節(jié)可能是獲取B細(xì)胞前體B系特異性的關(guān)鍵。

研究者前期實(shí)驗(yàn)研究證明，6周遞增運(yùn)動(dòng)過程中，機(jī)體根據(jù)運(yùn)動(dòng)需要，通過改變凋亡率，進(jìn)而改變?cè)缙诎l(fā)育中B細(xì)胞的數(shù)量百分比，以求盡可能維持免疫穩(wěn)態(tài)；“運(yùn)動(dòng)性免疫抑制”最初是針對(duì)T細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言的，經(jīng)過前期工作總結(jié)后，研究者認(rèn)為，針對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的發(fā)育分化調(diào)節(jié)而言，稱為“運(yùn)動(dòng)性免疫失衡”會(huì)更準(zhǔn)確、全面［1-6］。那么，在6周遞增運(yùn)動(dòng)過程中，對(duì)于早期B細(xì)胞發(fā)育起著關(guān)鍵調(diào)控作用的因子，如轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞因子和趨化因子等，在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中產(chǎn)生了怎樣的適應(yīng)性及應(yīng)答性變化？它們之間以及與Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞又有著怎樣的等級(jí)性調(diào)節(jié)？

基于此，在前期長期遞增負(fù)荷對(duì)早期B細(xì)胞在骨髓中發(fā)育影響的基礎(chǔ)上，根據(jù)B細(xì)胞發(fā)育第二關(guān)卡理論，分析6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的影響及其與Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞的相關(guān)關(guān)系，探討長期運(yùn)動(dòng)對(duì)骨髓早期B細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

雄性SD大鼠128只，8周齡，體重130～150g［許可證號(hào):SCXK（粵）2008-0020；NO:0043379，粵 監(jiān) 證 字F2008A002］。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（表1），實(shí)驗(yàn)組（96只）進(jìn)行6周遞增強(qiáng)度訓(xùn)練；絕對(duì)安靜組（對(duì)照組，32只）正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，分別于第0、2、4、6周末采樣，用于判別大鼠生長對(duì)測試指標(biāo)的影響（實(shí)驗(yàn)組實(shí)際參與運(yùn)動(dòng)的大鼠是106只，以備補(bǔ)充建模中意外死亡大鼠，本次建模因意外死亡大鼠2只）。

表1 本研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組情況一覽表 （只）Table 1 Grouping of Animals

1.2 運(yùn)動(dòng)模型設(shè)計(jì)、取材時(shí)間及建模測試指標(biāo)

參照Bedfor d（1979）根據(jù)大鼠體重／耗氧量回歸方程所建立的遞增負(fù)荷（跑臺(tái)坡度），課題組前期研究建立了運(yùn)動(dòng)性免疫失衡發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)物模型［7-12，15，16］:模擬 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練安排，長時(shí)間、高密度、大強(qiáng)度且負(fù)荷遞增，進(jìn)行持續(xù)6周的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，每次運(yùn)動(dòng)30min；適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練1周后，起始負(fù)荷定為20m／min，每周遞增負(fù)荷5m／min，至第6周達(dá)40m／min，到達(dá)大鼠最大強(qiáng)度負(fù)荷（表2）。

取材時(shí)間:第0周末，即運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前，完成1個(gè)定量運(yùn)動(dòng)負(fù)荷（10m／min），分別在運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)后即刻和運(yùn)動(dòng)后3h取材。第2、4、6周末訓(xùn)練完成后，休息1天，次日（大鼠運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)48h）完成同周相同定量運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，分別在運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)后即刻和運(yùn)動(dòng)后3h取材。對(duì)照組正常喂養(yǎng)，不運(yùn)動(dòng)，分別于第0、2、4、6周末處死，測試相同指標(biāo)，用于判別大鼠生長對(duì)這些指標(biāo)的影響。

無菌取得大鼠（股骨）骨髓和股骨（含骨髓）。大鼠骨髓直接用錫紙包好放在液氮中，用于mRNA和蛋白表達(dá)的研究；股骨則放入10%中性甲醛固定液內(nèi)固定，用于股骨脫鈣石蠟免疫組織化學(xué)檢測。

前期課題組成員已分別測試血液、T細(xì)胞活性、巨噬細(xì)胞吞噬能力、神經(jīng)遞質(zhì)等指標(biāo)，并監(jiān)測大鼠體重、皮毛亮度等指標(biāo)，通過比較對(duì)照組與訓(xùn)練組的差異，驗(yàn)證大鼠6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)性免疫失衡發(fā)生、發(fā)展的運(yùn)動(dòng)模型的建 立 是 成 功 的［7-12，15，16］。

表2 本研究運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練負(fù)荷方案一覽表Table 2 Protocol of Training in Rats （m／min）

1.3 要試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 股骨脫鈣免疫組織化學(xué)技術(shù)

1）室溫固定24h后，股骨放入EDTANa2液中脫鈣，換液每3天1次，約2月后，針刺無阻即為脫鈣完成；2）取股骨骨干和股骨頭的結(jié)合部做成蠟塊，股骨組織做4μm連續(xù)切片；3）常規(guī)脫臘至水；4）高壓抗原修復(fù)，PBS洗；5）3%H2O2室溫孵育15min，PBS洗；6）加 PAX5抗體（Sata cruz，sc-1974，1∶10稀釋），4℃過夜，PBS洗；7）滴加二抗，37℃孵育20min，PBS洗；8）DAB顯色劑鏡下觀察顯色；9）蘇木素復(fù)染核；10）脫水，透明，封片，其中，用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.3.2 Real time RT-PCR

采 用 SYBR Green I檢 測 法。RNAiso Plus、SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ、PrimeScriptTMRT reagent Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司（產(chǎn)品貨號(hào)分別是:D9108B、DRR081A、DRR037A）。

具體步驟:引物設(shè)計(jì)、樣本采集、總RNA的抽提（RNA的沉淀、清洗、溶解、貯存等）、總RNA樣品濃度分析及純度測定、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、Real Time PCR反應(yīng)、樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量的獲取。

引物由TAKARA寶生物工程（大連）有限公司合成（表3），用無菌去離子水稀釋為10μM濃度的工作液，分裝貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Western Blot

E2A購自 Abcam（貨號(hào):ab69999，1∶800稀釋）、EBF購自Sata cruz（貨號(hào):sc-137065，1∶400稀釋）。主要步驟:SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、膜的封閉、抗體雜交、顯色（ECM）、結(jié)果檢測。

表3 本研究E2A、EBF、PAX5的引物情況一覽表Table 3 Gene-specific Primers of E2A，EBF，PAX5

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 研究結(jié)果

2.1 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中骨髓轉(zhuǎn)錄因子E2A、EBF（WB）及PAX5（IHC）蛋白表達(dá)的變化

本研究6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中各組骨髓轉(zhuǎn)錄因子E2A、EBF（WB）蛋白表達(dá)見圖1，各組骨髓PAX5蛋白表達(dá)見圖2。對(duì)照組（絕對(duì)安靜組）各指標(biāo)各周之間沒有顯著性差異（P＞0.05），表明6周生長對(duì)這些指標(biāo)沒有顯著影響，下同。6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中，E2A、EBF及PAX5蛋白表達(dá)的變化特征（表4～表6）:第0周，各組間E2A、EBF、PAX5蛋白表達(dá)均無顯著性差異（P＞0.05）。第2周，與A組相比，J組E2A、EBF蛋白表達(dá)均顯著性下降（P＜0.05），3H組E2A、EBF蛋白表達(dá)組不具顯著性差異（P＞0.05），但PAX5呈顯著性上升（P＜0.05）；與J組相比，3H組E2A、EBF均不具顯著性差異（P＞0.05），PAX5顯著性上升（P＜0.05）。第4周，與A組相比，EBF蛋白表達(dá)在J組有非常顯著性下降（P＜0.01），3H組有顯著性上升（P＜0.05），而 E2A、PAX5在J組、3H 組均無顯著性差異（P＞0.05）；與J組相比，3H 組EBF、PAX5均有顯著性上升（P＜0.05）。第6周，與A組相比，J組E2A、EBF蛋白表達(dá)均不具顯著性差異（P＞0.05），PAX5在3H組有顯著性上升（P＜0.05）；與J組相比，3H 組E2A、PAX5均呈顯著性上升（P＜0.05）。

2.2 6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中E2A、EBF及PAX5基因表達(dá)的變化

表7～表9顯示:第0周，各組間E2A、PAX5基因表達(dá)均無顯著性差異（P＞0.05）；與A組相比，J組EBF基因表達(dá)呈現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05），3H有上升趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。第2周，與A組相比，J組E2A、EBF、PAX5基因表達(dá)均顯著性下降（P＜0.05），3H 組僅EBF具顯著性低下（P＜0.05）；與J相比，3H 組 E2A、PAX5均具顯著性上升（P＜0.05），EBF不具顯著性差異（P＞0.05）。第4周，與 A組相比，EBF、PAX5基因表達(dá)在J組有顯著性下降（P＜0.05），3H組無顯著性變化（P＞0.05），而 E2A 在J組、3H組均無顯著性差異（P＞0.05）；與J組相比，3H 組PAX5有顯著性上升（P＜0.05）。第6周，與A組相比，J組E2A、EBF、PAX5基因表達(dá)均顯著性下降（P＜0.05），3H 組E2A、EBF均無顯著性變化（P＞0.05），僅PAX5有顯著性下降（P＜0.05）；與J組相比，3H 組E2A、EBF、PAX5均無顯著性差異（P＞0.05）。注:＊、＊＊表示同周與AC組比較時(shí)P＜0.05、P＜0.01；﹟、﹟﹟表示同周A組比較時(shí)P＜0.05、P＜0.01；▲、▲▲表示同周與J組比較時(shí)P＜0.05、P＜0.01，下同。

圖1 本研究6周各組大鼠骨髓轉(zhuǎn)錄因子EBF、E2A蛋白表達(dá)示意圖Figure 1.Protein Expression of E2A，EBF（WB）in Bone Marrow for Six Weeks

圖2 本研究6周各組大鼠骨髓PAX5蛋白表達(dá)示意圖（石蠟組化切片，×400）Figure 2.Protein Expression of PAX5（IHC）in Bone Marrow for Six Weeks

表4 本研究骨髓轉(zhuǎn)錄因子E2A蛋白表達(dá)一覽表（Western Blot）Table 4 Changes of E2Ain Bone Marrow（Western Blot）

表5 本研究骨髓轉(zhuǎn)錄因子EBF蛋白表達(dá)一覽表（Western Blot）Table 5 Changes of EBF in Bone Marrow（Western Blot）

表6 本研究骨髓轉(zhuǎn)錄因子PAX5蛋白表達(dá)一覽表（免疫組化IOD值，×104）Table 6 Changes of IOD of PAX5in Bone Marrow（IHC，×104）

表7 本研究骨髓轉(zhuǎn)錄因子E2AmRNA表達(dá)一覽表Table 7 Changes of E2AmRNA in Bone Marrow

表8 本研究骨髓轉(zhuǎn)錄因子EBF mRNA表達(dá)一覽表Table 8 Changes of EBF mRNA in Bone Marrow

表9 本研究骨髓轉(zhuǎn)錄因子PAX5mRNA表達(dá)一覽表Table 9 Changes of PAX5mRNA in Bone Marrow

2.3 轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)與骨髓B系發(fā)育各階段細(xì)胞群的相關(guān)性

表10顯示，E2A蛋白表達(dá)與Pro B、Pre B的相關(guān)性分別為0.76、0.67；EBF蛋白表達(dá)與 Pro B、Pre B的相關(guān)性分別為0.82、0.89；PAX5蛋白表達(dá)與Pro B、Pre B的相關(guān)性分別為0.81、0.87。

表10 本研究E2A、EBF、PAX5蛋白表達(dá)與Pro B、Pre B細(xì)胞群的多元線性回歸分析一覽表Table10 E2A，EBF，PAX5Protein Expression in Multiple Linear Regression Analysis with Pro B，Pre B populations（r）

2.4 轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)與骨髓B系發(fā)育各階段細(xì)胞群的相關(guān)性

表11顯示，EBFmRNA與Pro B、Pre B的相關(guān)性分別為0.89、0.92；E2AmRNA與Pro B、Pre B的相關(guān)性分別為0.65、0.56；PAX5mRNA 與 Pro B、Pre B的相關(guān)性分別為0.76、0.84。

表11 本研究E2A、EBF、PAX5基因表達(dá)與Pro B、Pre B細(xì)胞群的多元線性回歸分析一覽表Table 11 E2AmRNA，EBF mRNA，PAX5mRNA in Multiple Linear Regression Analysis with Pro B，Pre B Cell Populations（r）

3 討論

機(jī)體具有連續(xù)生成新生血細(xì)胞以補(bǔ)充已分化成熟的衰老血細(xì)胞的維持造血?jiǎng)討B(tài)平衡的能力，這就需要對(duì)血細(xì)胞的生成進(jìn)行精密的調(diào)節(jié)控制。骨髓中的B淋巴細(xì)胞由造血干細(xì)胞接受分化信號(hào)后定向分化形成。

3.1 EBF、PAX5對(duì)發(fā)育中Pro B、Pre B細(xì)胞數(shù)量起主導(dǎo)調(diào)控作用

轉(zhuǎn)錄因子，如E2A，EBF和PAX5專一性地在B細(xì)胞譜系中進(jìn)行調(diào)節(jié)。在缺失E2A基因的小鼠中，只影響B(tài)細(xì)胞發(fā)育，而包括T淋巴細(xì)胞在內(nèi)的其他造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞系卻沒有明顯異常，此類小鼠體內(nèi)RAG-1、mbl、CD19、λ5和PAX-5轉(zhuǎn)錄消失，Ig重鏈V（D）J重排完全阻止，細(xì)胞發(fā)育停止在原B細(xì)胞［17］。E2A和EBF的協(xié)同作用對(duì)啟動(dòng)B細(xì)胞的分化是必需的，通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞的特異基因，如RAG-1，RAG-2（重組過程與以上基因的表達(dá)相關(guān)）、替代性輕鏈（λ5／VPre-B）、CD19、Igα（mb-1，CD79a）和Igβ（B29，CD79b）的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)［18］。骨髓原 B細(xì)胞分化階段，PAX5能抑制T細(xì)胞定型關(guān)鍵基因Notchl的表達(dá)，抑制T細(xì)胞發(fā)育程序，PAX5高表達(dá)以促進(jìn)B細(xì)胞發(fā)育，從而保證B細(xì)胞的特異性［19］。

Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞是淋巴樣干細(xì)胞中的一部分，在骨髓內(nèi)繼續(xù)分化成B細(xì)胞需經(jīng)歷的非抗原依賴階段的2個(gè)亞群，在整個(gè)B細(xì)胞發(fā)育過程中Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞有許多特征性的基因表達(dá)。

Pro B細(xì)胞是B細(xì)胞發(fā)育過程中重輕鏈基因尚未發(fā)生重排的胚系狀態(tài)，在骨髓基質(zhì)信號(hào)誘導(dǎo)刺激下，細(xì)胞表達(dá)RAG-1，RAG-2，以及編碼替代性輕鏈λ5和Vpre-B。

μ鏈在B細(xì)胞發(fā)育中起重要作用，因?yàn)棣替溔毕菪∈笃銪細(xì)胞發(fā)育阻滯在Pre B細(xì)胞階段。Pre-BCR由μ鏈、替代輕鏈 Vpre-B／λ5、Igα／β組成，雖然 Pre B細(xì)胞識(shí)別的配體尚不清楚，但此階段是B細(xì)胞發(fā)育中一個(gè)重要的關(guān)卡點(diǎn)。

EBF以同源二聚體的形式結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)在B細(xì)胞發(fā)育中起重要作用的基因的表達(dá)，如λ5，VpreB和mb-1（Igα）。剔除EBF的小鼠體內(nèi)，完全缺失成熟B細(xì)胞，B細(xì)胞的發(fā)育中斷在免疫球蛋白DH-JH重排前的Pro B細(xì)胞［23］。在 EBF-／-Pro B細(xì)胞中，PU.1和E2A基因表達(dá)，但檢測不到PAX5的轉(zhuǎn)錄，提示EBF受E2A的調(diào)控，先于PAX5在B細(xì)胞發(fā)育早期發(fā)揮作用。

在Pro B細(xì)胞向Pre B細(xì)胞分化過程中，EBF和E47（E2A）能協(xié)同誘導(dǎo)Pro B、Pre B細(xì)胞免疫球蛋白替代輕鏈λ5和Vpre-B的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)RAG-1，RAG-2來控制V（D）J重組。

由此可見，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中，E2A受運(yùn)動(dòng)的影響波動(dòng)幅度較小，而EBF、PAX5則波動(dòng)幅度較大。EBF、PAX5蛋白與骨髓Pro B、Pre B細(xì)胞數(shù)［1，2］有較高的相關(guān)系數(shù)，再次提示轉(zhuǎn)錄因子EBF、PAX5對(duì)發(fā)育中Pro B、Pre B細(xì)胞數(shù)量起主導(dǎo)調(diào)控作用。

3.2 EBFmRNA對(duì)早期B細(xì)胞發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控作用更加關(guān)鍵

在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中，僅特異轉(zhuǎn)錄因子的EBF蛋白表達(dá)水平與EBF基因表達(dá)有較相似的趨勢，E2A、PAX5基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)不同步，推測其可能原因是:基因表達(dá)對(duì)蛋白質(zhì)合成只是具有指導(dǎo)性合成的作用，影響蛋白質(zhì)表達(dá)除了此因素，還與合成酶的活性、合成底物的充足與否等多種因素有關(guān)。此外，還可能涉及基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

研究結(jié)果顯示，EBFmRNA在一次性運(yùn)動(dòng)后即有顯著的應(yīng)答反應(yīng)，即EBF基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)運(yùn)動(dòng)刺激更為敏感，短時(shí)間的運(yùn)動(dòng)即可以誘導(dǎo)其表達(dá)。EBFmRNA與Pro B、Pre B有更高的相關(guān)系數(shù)（表11），再次提示EBFmRNA對(duì)B細(xì)胞發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控作用更關(guān)鍵。

有研究［20-22］認(rèn)為，E2A主要調(diào)控EBF的表達(dá)，E2A與EBF再進(jìn)一步調(diào)控PAX5的表達(dá)。本研究中結(jié)果顯示，在運(yùn)動(dòng)的影響下，對(duì)早期B細(xì)胞發(fā)育的起特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的因子中，EBF比上級(jí)調(diào)控因子E2A和下游調(diào)控因子PAX5作用更為突出。

前期研究顯示，PU.1、E2A、EBF、PAX5在B細(xì)胞的分化中有等級(jí)性調(diào)節(jié)關(guān)系。如PU.1正性調(diào)節(jié)EBF的表達(dá)，而在造血前體細(xì)胞，加強(qiáng)的EBF表達(dá)能夠恢復(fù)在PU.1缺失時(shí)受損B細(xì)胞的發(fā)育。PAX5是EBF的靶基因，但異位的PAX5并不能恢復(fù)在PU.1缺失時(shí)B細(xì)胞的發(fā)育。此外，EBF在抑制非B系細(xì)胞如T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞中起了重要作用。

EBF表達(dá)的調(diào)節(jié)，對(duì)B細(xì)胞發(fā)育的早期階段，如共同淋巴樣前體（CLP）和Pre-pro B（前祖B細(xì)胞）細(xì)胞階段，起到了關(guān)鍵的系譜特異定型的作用，即導(dǎo)向性的指引未定型的多能淋巴系干細(xì)胞前體向B細(xì)胞系譜分化。研究表明，EBF在無PAX5存在時(shí)，可以限制淋巴系干細(xì)胞向B系細(xì)胞的分化并促進(jìn)B系細(xì)胞定型［21］。

Seet CS等［22］發(fā)現(xiàn)，在阻止E2A的表達(dá)并伴隨IL-7的低刺激的條件下，EBF也能夠起到促進(jìn)B細(xì)胞增殖的關(guān)鍵作用。他們發(fā)現(xiàn)缺失E2A基因小鼠，被阻斷的B細(xì)胞增殖可以因EBF的表達(dá)而非PAX5的表達(dá)而得到修復(fù)，通過促成絕大多數(shù)B細(xì)胞系譜基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，提示在早期B系細(xì)胞的發(fā)育中，EBF是E2A不可缺少的靶基因。

也有研究［20］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，由于E2A利于N-myc的表達(dá)，E2A蛋白對(duì)于依賴IL-7的細(xì)胞增殖也是必需的，因此，高濃度的E蛋白對(duì)于EBF和N-myc的激活是必須的；而低濃度的E蛋白，在其他B系轉(zhuǎn)錄因子如EBF的表達(dá)的協(xié)同下，也能夠發(fā)揮促進(jìn)大多數(shù)B系細(xì)胞基因表達(dá)的作用。

如圖3所示，本課題研究希望進(jìn)一步通過組織學(xué)觀察、細(xì)胞水平、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子及其受體、趨化因子及其受體、Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等的層面進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)性免疫失衡的調(diào)控機(jī)制及干預(yù)措施。

圖3 本研究實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)在第2周的變化及相互關(guān)聯(lián)示意圖Figure 3.The Response and Correlating of Laboratoy Indexes at WK2

4 結(jié)論與建議

1.6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中，E2A受運(yùn)動(dòng)的影響波動(dòng)幅度較小，而EBF、PAX5則波動(dòng)幅度較大。EBF、PAX5蛋白與骨髓Pro B、Pre B細(xì)胞數(shù)的相關(guān)度，再次提示轉(zhuǎn)錄因子EBF、PAX5對(duì)發(fā)育中Pro B、Pre B細(xì)胞數(shù)量起主導(dǎo)調(diào)控作用。

2.E2A、PAX5的蛋白與基因表達(dá)不同步，提示基因表達(dá)對(duì)蛋白質(zhì)只是具有指導(dǎo)性合成的作用，還可能涉及基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.EBFmRNA在WK0呈現(xiàn)波動(dòng)，提示EBF基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)運(yùn)動(dòng)刺激更為敏感，并發(fā)現(xiàn)EBF比上級(jí)調(diào)控因子E2A和下游調(diào)控因子PAX5對(duì)B細(xì)胞發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控作用更加關(guān)鍵，對(duì)研究運(yùn)動(dòng)性免疫調(diào)理、延緩疲勞的意義重大。

［1］耿青青.長期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)骨髓早期B淋巴細(xì)胞發(fā)育的影響［D］.華南師范大學(xué)博士學(xué)位論文，2010.

［2］耿青青，郝選明.長期遞增負(fù)荷跑臺(tái)對(duì)大鼠骨髓Pro B細(xì)胞、Pre B細(xì)胞發(fā)育的影響［J］.廣州體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，31（5）:101-105.

［3］耿青青，郝選明.遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中調(diào)控淋巴細(xì)胞發(fā)育分化的轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)變化［C］.第九屆全國體育科學(xué)大會(huì)，上海，2011.

［4］耿青青，郝選明.骨髓中IL-7、IL-7R及EBF表達(dá)與運(yùn)動(dòng)性免疫失衡［J］.體育學(xué)刊，2011，18（1）:139-144.

［5］耿青青，郝選明.免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子與延遲性肌肉酸痛癥［J］.體育學(xué)刊，2009，16（12）:107-112.

［6］李杰.大鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2和sIL-2R對(duì)長期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答和適應(yīng)特征［D］.華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007.

［7］林玲.大鼠心肌HSP70、自由基代謝和Na＋-K＋-ATPase活性對(duì)有氧耐力運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答性和適應(yīng)性變化［D］.華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2003.

［8］劉剛.大鼠抗氧化能力對(duì)有氧耐力運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答和適應(yīng)及納米硒對(duì)其影響［D］.華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2003.

［9］陸小香，張?zhí)N琨，江年.力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠海馬CA1區(qū)自由基、下丘腦GABA及HPA軸的動(dòng)態(tài)變化［J］.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，26（5）:563-567.

［10］權(quán)德慶.體育統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.北京:人民體育出版社，2011.

［11］唐亮.大鼠細(xì)胞免疫功能對(duì)六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答性和適應(yīng)性特征［D］.華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007.

［12］萬發(fā)達(dá).血細(xì)胞和血紅蛋白對(duì)長期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)與適應(yīng)特征［D］.華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

［13］FRASCA D，BLOMBERG B B.Aging impairs murine B cell differentiation and function in primary and secondary lymphoid tissues［J］.Aging Dis，2011，2（5）:361-373.

［14］FRETZ J A，NELSON T，XI Y，ADAMS D J，et al.Altered metabolism and lipodystrophy in the early B-cell factor 1-deficient mouse［J］.Endocrinology，2010，151（4）:1611-1621.

［15］GENG Q Q.Effects of Long-term Incremental Exercise on the Transcription Factor in Development of Early Precursor B Lymphocytes in Rats Bone［C］.The International Convention on Science，Education and Medicine in Sport，2012.

［16］GENG Q Q，HAO X M.The effect of long-term incremental exercise on Glutamate Decarboxylase in the hippocampus of rats［C］.The international convention on Science，Education and Medicine in Sport，2008.

［17］GOSTISSA M，RANGANATH S，BIANCO J M，et al.Chromosomal location targets different MYC family gene members for oncogenic translocations［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（7）:2265-2270.

［18］HAO X M，LI J，HUANG Z G.Response and adaptation of IL-2and sIL-2Rsecreted from lymphocytes during long-term exercise in rats［C］.The International Convention on Science，Education and Medicine in Sport，2008.

［19］HAO X M，ZENG Z G，HUANG Z G.The response and adaptation of neurtransmitters（Ach.DA.NA.AD）in the hypothalamic arcuate nucleus during long-term exercise［C］.The International Convention on Science，Education and Medicine in Sport，2008.

［20］HUGHES D J，DICKERSON C A，SHANER M S，et al.Trans-Repression of protein expression dependent on the Epstein-Barr virus promoter Wp during latency［J］.J Virol，2011，85（21）:11435-11447.

［21］PONGUBALA J M，NORTHRUP D L，LANCKI D W，et al.Transcription factor EBF restricts alternative lineage options and promotes B cell fate commitment independently of Pax5［J］.Nat Immunol，2008，9（2）:203-215.

［22］SEET C S，BRUMBAUGH R L，KEE B L.Early B cell factor promotes B lymphopoiesis with reduced interleukin 7responsiveness in the absence of E2A［J］.J Exp Med，2004，199（12）:1689-1700.

［23］YABUKI M，ORDINARIO E C，CUMMINGS W J，et al.E2A acts in cis in G1phase of cell cycle to promote Ig gene diversification［J］.J Immunol，2009，182（1）:408-415.