陳新華，譚先偉，倪建宏，張 賓，劉長彬

(1.新疆生產建設兵團農四師77團，新疆 昭蘇 835601;2.新疆農墾科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000)

動物胚胎移植是現代畜牧業(yè)發(fā)展史上的一次技術革命，由于其可以加快優(yōu)良品種擴繁速度，縮短繁育周期，減少生殖道疾病和傳染病的發(fā)生率，降低牲畜在品種運輸中產生的成本等，在生產上的應用越來越廣泛[1]。羊胚胎移植技術是借助一定的儀器設備，采用微創(chuàng)手術的方式，將優(yōu)良品種的胚胎，移植到同類普通品種的生殖道內，俗稱“借腹懷胎”。胚胎移植技術在品種改良工作中起到積極的推動作用[2，3]。1890 年英國劍橋大學希普(W Heape)首次在安哥拉兔上通過胚胎移植獲得后代，標志著首次家畜胚胎移植的成功，胚胎移植技術已經有100多年歷史。1934年美國的Warwick等在綿羊的胚胎移植上獲得成功。1973年Wilmut等超低溫(液氮)保存胚胎獲得成功。20世紀30年代在綿羊和山羊上獲得成功，但直到1950年后胚胎移植技術才有較大發(fā)展[4]。我國從20世紀70年代后期開始將胚胎移植應用到畜牧業(yè)生產上，首先在家兔上獲得成功，之后分別在綿羊、牛、小鼠、奶山羊上獲得成功[5]。隨著國內畜牧業(yè)的發(fā)展，胚胎移植越來越受到人們的重視。目前，我國的羊胚胎移植技術已經成熟，在生產實踐中已得到大范圍的推廣應用，為我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受體羊 無繁殖及傳染性疾病的3～5歲健康本地雜交羊。受體母羊最好出自本地區(qū)現有的羊只，檢查布魯氏桿菌病及結核病，淘汰陽性羊;膘情在中等以上;必須在當年產過一胎羔羊，且目前羔羊成活。挑出患有乳腺炎的羊只、四肢殘疾羊、個體較大的羊。杜絕羊群內的公羊。

1.1.2 實驗設備 擁有自主知識產權的羊專用胚胎移植手術架，腹腔內窺鏡一套(OLYMPUS，Japan)，實體顯微鏡(NIKON，Japan)，CO2鋼瓶(國產)，恒溫水浴鍋、手術刀、止血鉗、剪刀、持針鉗、注射器(1 mL、5 mL、20 mL)、胚胎移植管、四孔板、Holding液、溫度計、創(chuàng)巾、布膠帶、曲別針、縫合針及線、工作服、碘酒及酒精、消毒液、牛皮紙、衛(wèi)生紙等。

1.1.3 實驗藥品 陰道海綿栓、孕馬血清促性腺激素(PMSG，1000IU/瓶)、青霉素、速眠新及蘇醒靈(長春農牧大學軍事獸醫(yī)研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 同期發(fā)情 受體羊均采用陰道海綿栓誘導發(fā)情。放栓的任意一天為第0天，第13天撤栓，撤栓同時注射PMSG 400 IU，隔天開始試情，若接受試情公羊爬跨而不反抗的即為發(fā)情羊只，進行標記，7 d后進行胚胎移植。

1.2.2 胚胎鑒定 在體視鏡下對解凍后的胚胎進行分級鑒定，根據胚胎形態(tài)的完整性及內細胞團的形態(tài)特征分為A、B、C級。透明帶內細胞團呈均勻對稱的球形，形態(tài)典型，單個分裂球的大小、顏色、密度一致，輪廓清晰，胚胎發(fā)育階段與預期的發(fā)育階段一致者為A級。透明帶內細胞團的大小和形狀以及單個細胞的顏色和密度存在一定的不規(guī)側，細胞質較致密，分布均勻，具有完好的、具活性的胚胎細胞團者為B級。透明帶內細胞團的大小和形狀以及單個細胞有明顯變異，分裂球輪廓稍不清晰，或部分不清晰，細胞質不致密，分布不均勻，色調發(fā)暗，但仍有部分細胞結構是完好的、具有活性的胚胎細胞團者為C級。

1.2.3 胚胎移植 采用微創(chuàng)手術，用移胚針將符合移植要求的胚胎移植到同期化受體羊的子宮角內。在進行移植操作時，利用內窺鏡觀察只有卵巢上有黃體發(fā)育的個體才能移植。

1.2.4 手術 在發(fā)情的第6天受體羊短時斷水24 h，第7天進行胚胎移植。將受體羊保定于手術架上，固定前、后肢，將乳房向前、腹中線兩側剃除面積巴掌大小的腹毛，3%碘酊消毒，75% 酒精脫碘手術部位，在乳房前3～5 cm與腹中線左或右側3～5 cm交點處，避開乳靜脈及體表較大靜脈下刀，切開皮膚和腹膜，刀口長2 cm左右。

1.2.5 縫合 胚胎移植后，輕輕提起腹壁皮膚或用手輕輕按住子宮體及子宮角自然回復腹腔內。由于切口較小可以采用腹膜與肌肉皮膚進行兩層縫合(如切口皮膚和肌肉層錯位且不出血的情況下可以不縫合)?？p合結束后，肌肉注射青霉素G 80萬單位，用3%碘酊消毒創(chuàng)口。

1.2.6 妊娠檢查 于胚胎移植后的50～60 d進行B超檢查。

2 結果

經B超檢查并統(tǒng)計受胎率，詳見表1。

表1 超細毛羊胚胎移植效果

3 討論

羊胚胎移植受諸多因素的影響。據報道，不同處理方案、胚胎保存環(huán)境、保存液配方、胚胎級別鑒定準確度、手術操作時手法技巧、手術后子宮內環(huán)境的變化、受體羊發(fā)情同期化程度、移植時受體羊所處的增重狀態(tài)、受體羊的年齡、飼養(yǎng)狀況、管理狀態(tài)等是影響羊受胎率的重要因素。發(fā)情表現的啟動主要體現在促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放，GnRH刺激 FSH分泌，FSH促進卵泡的發(fā)育，發(fā)情開始啟動[6]。有研究者認為在同期發(fā)情處理的第13天血液中E2分泌量達到峰值，反饋引起LH分泌增加至峰值引起排卵[7～10]。嚴格受體羊的挑選標準，選擇體況適宜或膘情稍差的羊只作為受體羊，這些羊胚胎移植后經過近1個月的補飼體況很快能得到改善和提高。受體羊在移植后這段時間的飼養(yǎng)管理，膘情上升較快，滿足了體內胚胎生長發(fā)育需要，此時受胎率要比在胚胎移植時就有較好膘情的受體要高一些。蛋白質水平高低直接影響受體的生殖內分泌活動而間接影響胚胎的發(fā)育。蛋白質水平過高時，機體組織中氨、尿素及其他含氮化合物濃度升高，血液中較高的氮和尿素濃度引起生殖系統(tǒng)中氨和尿素含量升高會影響胚胎存活[11]。

綜上所述，受體羊在飼養(yǎng)、管理環(huán)節(jié)上主要采用放牧加補飼，其中補飼主要以補飼優(yōu)質干草為主;或者在圈養(yǎng)的條件下，給受體羊提供優(yōu)質干草，尤以牧草種類繁多的天然草場收割的牧草為好。在管理上主要是保障每只受體羊都能有足夠的采食時間。給足采食時間，受體羊才能采食更多的干草，才能攝入更多的干物質，才能保障瘤胃微生物區(qū)系的需要，才能有助于受體羊營養(yǎng)的全面。

胚胎移植技術是第二次生物技術革命，給畜牧業(yè)發(fā)展帶來舉足輕重的作用。同時胚胎移植技術也是一個復雜的系統(tǒng)工程，在實踐操作中忽視任何一個環(huán)節(jié)都將以失敗告終。本次冷凍胚胎移植能夠取得較好成績與嚴格的受體羊選擇、精心飼養(yǎng)和管理等各環(huán)節(jié)密不可分。

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