劉瑞風(fēng)，劉新峰，郝志明

(1.天津市神澤農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，天津 301721;2.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，天津 300384)

與自然本交相比，人工授精和胚胎移植的妊娠成功率和產(chǎn)仔率都還較低，特別是胚胎移植，其妊娠率還有較大的差距，嚴(yán)重影響了其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用，成為胚胎移植技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸。比較自然本交妊娠和胚胎移植妊娠可以發(fā)現(xiàn)，在胚胎移植情況下，特別是家畜的胚胎移植，胚胎生長發(fā)育的子宮環(huán)境常常并未與精液接觸。

近年來的研究表明，精液與子宮內(nèi)膜的接觸能夠促進(jìn)胚胎的生長，能夠提高母畜的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。Carp H J等研究發(fā)現(xiàn)，不與結(jié)扎輸精管的公鼠交配，胚胎移植受體鼠的胚泡著床率會(huì)下降，胚胎的發(fā)育生長會(huì)減緩[1]。在家畜，胚胎移植受體母畜若未與輸精管結(jié)扎的公畜交配，移植的胚胎雖能正常附植，但胎兒生長和胎盤發(fā)育緩慢[2]。另外，Mah J等在進(jìn)行豬的配種時(shí)發(fā)現(xiàn)，自然本交的母豬，若再用輸精管結(jié)扎的公豬交配來補(bǔ)充精漿能夠提高母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)[3]?；诖?，本試驗(yàn)擬就精液對(duì)兔子宮免疫及孕向發(fā)育的影響進(jìn)行探究，以期揭示接觸精液的子宮所發(fā)生的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特性的變化，為提高人工授精和胚胎移植的成功率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康的新西蘭白兔10只，空懷，體重2.0～2.5 kg，其中母兔8只，公兔2只。試驗(yàn)動(dòng)物購買后，飼養(yǎng)觀察兩周再進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)前和試驗(yàn)期間，試驗(yàn)兔飼養(yǎng)在室溫條件下，喂以青草和兔專用配合飼料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精液的采集

采精時(shí)，一手抓住母兔的兩耳及頸部皮膚將其保定好，使母兔后軀朝向籠內(nèi)，另一手將自制假陰道置于母兔兩后肢之間，假陰道開口緊貼母兔外陰部，并使假陰道與水平面呈30°。當(dāng)公兔爬跨母兔并伸出陰莖時(shí)，立即將假陰道套于陰莖上。射精時(shí)，公兔會(huì)尖叫一聲倒向一側(cè)，這時(shí)應(yīng)將母兔放開，豎直假陰道，讓精液流入集精杯。

1.2.2 母兔誘導(dǎo)發(fā)情和誘發(fā)排卵

為了模擬發(fā)情排卵后母兔的生理狀態(tài)，試驗(yàn)?zāi)竿眯柽M(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)情和誘發(fā)排卵處理。

誘導(dǎo)發(fā)情處理:所用藥物為孕馬血清(PMSG，寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)070108)，按照50IU/kg的劑量，于早上6:00～7:00一次頸部皮下注射。

誘發(fā)排卵處理:在PMSG注射后約50 h前后，當(dāng)母兔陰戶濕潤腫大，陰道黏膜潮紅，并接受試情公兔爬跨時(shí)，將無菌玻璃棒插入陰道，以此來刺激陰道，誘發(fā)排卵。

1.2.3 精液宮內(nèi)注入手術(shù)

誘發(fā)排卵處理后4 h進(jìn)行精液宮內(nèi)注入手術(shù)。手術(shù)方法:犬眠寶(0.1 mL/kg)皮下注射麻醉。在最后一對(duì)乳頭前約1 cm的腹中線處，常規(guī)手術(shù)方法打開腹壁。當(dāng)腹壁打開后，小指伸入腹腔，觸摸拉出子宮。用縫線結(jié)扎兩側(cè)子宮頸，以防注入兩側(cè)子宮角的液體混合，并以縫線打結(jié)方式在一側(cè)子宮角作標(biāo)記。分別在兩側(cè)子宮角注入0.3 mL新鮮精液(試驗(yàn)組)或生理鹽水(對(duì)照組)。然后將子宮送回腹腔，常規(guī)方法縫合腹壁并消毒。

1.3 子宮的采集和分析

1.3.1 子宮大小和重量的測(cè)量

精液宮內(nèi)注入手術(shù)后48 h，處死試驗(yàn)兔，完整摘取子宮，去除周圍脂肪等組織，拍照。用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量兩側(cè)子宮角的長度和直徑，并分別進(jìn)行稱重。根據(jù)體重和子宮角重量，計(jì)算子宮角指數(shù)。

子宮角指數(shù)=一側(cè)子宮角重量(g)/體重(kg)

1.3.2 子宮組織切片制作和觀察測(cè)定

按常規(guī)方法進(jìn)行制片，并分別進(jìn)行HE和甲苯胺蘭染色。顯微鏡下利用計(jì)算機(jī)圖像采集系統(tǒng)分別測(cè)量子宮壁、子宮肌層、黏膜層、黏膜上皮和腺上皮的厚度以及腺體的周長，計(jì)數(shù)子宮黏膜單位面積內(nèi)的血管、腺體和肥大細(xì)胞數(shù)量。每個(gè)切片采集10個(gè)視野進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，最后算出平均數(shù)。

1.3.3 子宮沖洗液體細(xì)胞計(jì)數(shù)和涂片染色觀察

自子宮角基部剪斷子宮，吸取1 mL無菌生理鹽水，從宮管結(jié)合部向子宮角基部沖洗子宮腔，收集沖洗液。子宮沖洗液體細(xì)胞計(jì)數(shù)按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行。為確定子宮沖洗液中的細(xì)胞類型，還進(jìn)行了涂片姬姆薩染色觀察。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用樣本均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，并用PSPS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 精液對(duì)子宮免疫的影響

同一子宮的兩個(gè)子宮角分別注入生理鹽水(對(duì)照組)和精液后48 h，子宮黏膜內(nèi)的肥大細(xì)胞數(shù)分別為3.72±0.04/mm2和2.85±0.05/mm2，精液組子宮黏膜的肥大細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05);兩子宮角沖洗液中的細(xì)胞數(shù)也有很大差異，對(duì)照組為8.87±0.36×109/L，精液組為53.3±4.03×109/L，精液組極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，詳見表1。子宮沖洗液涂片染色檢查發(fā)現(xiàn)，子宮沖洗液細(xì)胞主要為嗜中性粒細(xì)胞。

表1 精液對(duì)子宮黏膜肥大細(xì)胞數(shù)及子宮沖洗液體細(xì)胞數(shù)的影響

2.2 精液對(duì)子宮孕向發(fā)育的影響

2.2.1 對(duì)子宮大小和子宮角指數(shù)的影響從表2看，宮內(nèi)注入精液可使子宮角指數(shù)明顯增加(P＜0.05)，子宮角長度顯著延長(P＜0.05)，子宮角明顯增粗(P＜0.05)。

表2 精液對(duì)子宮角指數(shù)、長度及直徑的影響

對(duì)照組子宮角指數(shù)、子宮角長和子宮角直徑分別為 0.85±0.07 cm、5.58±0.30 cm和0.80 ±0.05 cm，而精液組則分別為1.30±0.04 cm、6.93±0.32 cm和0.90±0.04 cm。

2.2.2 對(duì)子宮壁、黏膜層、黏膜上皮層和肌層厚度的影響

表3 精液對(duì)子宮壁、黏膜層、黏膜上皮層及肌層厚度的影響

子宮注入精液后48 h，子宮壁、黏膜層、黏膜上皮層和肌層的厚度分別達(dá)到1.92±0.03 mm、1.51±0.02 mm、2.06±0.02 μm和0.29±0.06 mm。與對(duì)照組相比，子宮壁及黏膜層的厚度顯著增加(P＜0.05)，黏膜上皮層的厚度極顯著增加(P＜0.01)，子宮肌層的厚度雖有增加但差異不顯著(P﹥0.05)，詳見表3。

2.2.3 對(duì)黏膜腺體和血管的影響

表4 精液對(duì)子宮黏膜腺體數(shù)、腺上皮厚、腺體周長以及血管數(shù)的影響

由表4可見，子宮注入精液后，每平方毫米子宮黏膜內(nèi)的腺體數(shù)量較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，達(dá)11.75±0.27個(gè);腺上皮厚度較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)，達(dá)1.65±0.03 μm;腺體周長與對(duì)照組比較則沒有明顯差異(P﹥0.05)。另外，每平方毫米子宮黏膜內(nèi)的血管數(shù)精液組較對(duì)照組也有明顯增加(P＜0.05)。

3 討論

3.1 精液對(duì)子宮免疫的影響

在整個(gè)妊娠期，小鼠和田鼠子宮壁內(nèi)肥大細(xì)胞的數(shù)量都呈先減少后增加的變化，據(jù)認(rèn)為，這種變化與胚泡的附植有關(guān)[4]。胚泡植入子宮壁時(shí)肥大細(xì)胞數(shù)量減少，可使子宮局部免疫水平暫時(shí)低下，從而使具有父方抗原特征的胚泡不被排斥，可能是胚泡不被母體排斥的免疫學(xué)機(jī)制之一。本試驗(yàn)就精液對(duì)子宮壁肥大細(xì)胞數(shù)量的影響也進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，兔的精液也可明顯降低母兔子宮壁肥大細(xì)胞數(shù)量，生理鹽水組子宮壁肥大細(xì)胞數(shù)為3.72±0.04個(gè)/mm2，而精液組只有2.85±0.05個(gè)/mm2。另外，從我們的試驗(yàn)看，妊娠早期母兔子宮肥大細(xì)胞數(shù)量的減少可能是從子宮接觸精液開始的，精液有可能是子宮肥大細(xì)胞減少的啟動(dòng)物。

交配后白細(xì)胞遷移進(jìn)入子宮腔是精子上行過程中的重要組成部分[5，6]。許多研究顯示，豬交配后精液可誘導(dǎo)子宮發(fā)生炎癥反應(yīng)，可使大量多核嗜中性粒細(xì)胞(PMN)進(jìn)入子宮腔[6]。在母馬也有類似現(xiàn)象[7]。與上述研究結(jié)果相似，本試驗(yàn)在兔同一子宮的兩側(cè)子宮角分別注入精液和生理鹽水后，注入精液側(cè)的子宮角腔沖洗液中的細(xì)胞數(shù)極顯著高于對(duì)照子宮角腔沖洗液中的細(xì)胞數(shù);對(duì)子宮沖洗液細(xì)胞涂片染色檢查發(fā)現(xiàn)，其中主要也是嗜中性粒細(xì)胞。

3.2 精液對(duì)子宮孕向發(fā)育的影響

我們知道，動(dòng)物發(fā)情排卵后，殘留的卵泡發(fā)育轉(zhuǎn)變?yōu)辄S體，使子宮由雌激素誘導(dǎo)下的發(fā)育轉(zhuǎn)變成由孕酮誘導(dǎo)下的發(fā)育，從而導(dǎo)致子宮的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化。這些變化主要表現(xiàn)為子宮黏膜上皮的生長;子宮腺的增生，腺體的彎曲和分支增多，分泌物增加;以及子宮頸的收縮等[8]。子宮的這種在孕酮作用下的發(fā)育就叫孕向發(fā)育。

在發(fā)情排卵時(shí)通過自然本交或人工授精輸入雌性生殖道的精液對(duì)妊娠有什么作用已有一些報(bào)道。在豬，自然交配的同時(shí)給母豬輸入精漿可使母豬的產(chǎn)仔率由70%提高到80%，即使在既進(jìn)行人工授精又進(jìn)行自然本交的母豬，若再輸入精漿也能提高產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)[9]。對(duì)生殖道遭受過感染的雌性動(dòng)物，人工授精時(shí)增加精漿輸入量可提高這些動(dòng)物的妊娠率和產(chǎn)仔率[10]。在家畜，胚胎移植受體母畜若未與輸精管結(jié)扎的公畜交配，移植的胚胎雖能正常附植，但胎兒生長和胎盤發(fā)育緩慢[2]。另外在大鼠和小鼠的研究也表明，胚胎移植受體動(dòng)物子宮在移植前與精漿接觸，能促進(jìn)胚胎的卵裂和胚泡的附植，能提高胚胎和胎兒的發(fā)育速度，減少流產(chǎn)和畸形胎兒的產(chǎn)生[11，1]?？梢酝茰y(cè)，精漿的這些作用肯定是對(duì)子宮原有的孕向發(fā)育產(chǎn)生影響，從而改變了胚胎發(fā)育賴以生存的子宮內(nèi)環(huán)境所致。

精液對(duì)子宮的孕向發(fā)育到底有什么樣的影響，我們還未見到一篇有關(guān)的報(bào)道。從本研究的試驗(yàn)結(jié)果來看，精液注入48 h后，可以顯著增加子宮的大小;可明顯增加子宮壁、黏膜層和黏膜上皮層的厚度;可明顯增加黏膜中腺管和血管的數(shù)量，可顯著增加腺上皮的厚度。

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