高世勇，王 靜，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)是藻膽蛋白的一種，它廣泛存在于紅藻和龍須菜等植物中.根據(jù)來源藻紅蛋白可以被分為C-PE，B-PE，R-PE等，由脫輔基蛋白和開鏈四吡咯發(fā)色團經(jīng)硫醚鍵共價結(jié)合形成并可以發(fā)出橙紅色的熒光.PE的光吸收峰位于490～570 nm之間，有的PE可產(chǎn)生兩個吸收峰，有的PE可產(chǎn)生3個吸收峰[1].藻紅蛋白有廣泛的藥理作用，其中抗腫瘤方面的作用尤為突出.藻紅蛋白可以作為熒光探針應(yīng)用于熒光激活細胞分選、免疫組織化學(xué)、流式細胞測定、共聚焦激光顯微鏡、免疫細胞化學(xué)等熒光免疫的檢測[2].藻紅蛋白也可以作為光敏劑通過光動力學(xué)治療腫瘤.雖然藻紅蛋白介導(dǎo)的光敏反應(yīng)能誘導(dǎo)人肝癌7721細胞和S180細胞的凋亡，但是其直接抗腫瘤作用及其機制的研究卻很少[3].本文以人乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，觀察不同質(zhì)量濃度的藻紅蛋白對MCF-7細胞的生長抑制及凋亡作用，并檢測了通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)線粒體膜電位變化誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡的作用.探討藻紅蛋白對MCF-7細胞的凋亡作用機制.

1 實驗材料

1.1 細胞株和試劑

人乳腺癌MCF-7細胞株由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所博士后科研工作站傳代保種.藻紅蛋白由磐安縣鴻瑞生物科技有限公司提供.RPMI1640及胰酶為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品，溴化四氮唑藍(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品，二甲基亞砜(DMSO)為上海前塵生物科技有限公司產(chǎn)品，Hoechst33258染色試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，TMRM為美國Molecular probe公司產(chǎn)品.

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱，美國NBS公司;酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司;熒光顯微鏡，德國Leica公司;激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Leica公司.

2 實驗方法

2.1 腫瘤細胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，呈對數(shù)生長期時，0.25%胰酶消化細胞，加入RPMI1640培養(yǎng)液將消化下來的細胞吹打均勻，調(diào)整細胞至適當(dāng)質(zhì)量濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量，3～4 d傳代1次.

2.2 MTT法測定腫瘤細胞存活率

將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞用胰酶消化，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為2×104個/mL的細胞懸液，按每孔100μL接種于96孔板當(dāng)中，放置于37℃，含5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入100μL含不同質(zhì)量濃度的PE每劑量設(shè)6個平行孔;陰性組加相同體積的培養(yǎng)液;陽性對照組藥為阿霉素，給藥后于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去上清，每孔加入200μL新鮮配制含0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加150 μL DMSO溶解，微型振蕩器振蕩混勻，酶標(biāo)儀測定光密度值(OD)，參考波長490 nm，檢測波長570 nm.用下面公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，并按中效方程計算IC50.

2.3 倒置顯微鏡觀察藻紅蛋白對細胞形態(tài)學(xué)的影響

取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細胞，調(diào)整細胞濃度為105個/mL接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后加入不同質(zhì)量濃度的藻紅蛋白，置37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，置顯微鏡下觀察細胞形態(tài).

2.4 Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察藻紅蛋白對MCF-7細胞形態(tài)學(xué)影響

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕吹打后制備獲得單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度為1.5×105個/mL，接種于6孔板內(nèi)，置于37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同質(zhì)量濃度的藻紅蛋白，使其終質(zhì)量濃度分別為40、80、160μg/mL;陽性對照組加入阿霉素，藥物質(zhì)量終濃度為5μg/mL;陰性對照組加入相同體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸出舊培養(yǎng)液，加入1 mLPBS洗滌1次，吸出洗液，加入1mL胰蛋白酶進行消化，吸出消化液，加入2 mL新鮮的培基終止消化，將細胞完全吹下，吸至離心管中，2 000 r/min，10 min離心，棄上清，加入多聚甲醛固定30min，除去固定液，用PBS洗滌1次，吸盡液體，加入2 mL Hoechst33258染色液，37℃避光孵育30 min，移入六孔板內(nèi)，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，拍照.

2.5 流式細胞儀測定藻紅蛋白誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡的凋亡率

人乳腺癌MCF-7細胞以每瓶106個/mL接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，加入不同質(zhì)量濃度的藻紅蛋白使其終質(zhì)量濃度分別為40、80、160μg/L培養(yǎng)48 h，收集細胞，1 500 r/m離心5 min，PBS洗1次，70%冰乙醇-20℃固定過夜，PBS洗1次，加入PI染液(含PI 50mg/mL，RNase 1g/L，0.1%TritonX-100)，調(diào)整細胞為106個/mL，4℃避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，檢測細胞數(shù)為104個.

2.6 激光共聚焦顯微鏡檢測MCF-7細胞中線粒體膜電位的變化

取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細胞濃度為105個/mL細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h.24 h后加入不同質(zhì)量濃度的藻紅蛋白，使其終質(zhì)量濃度分別25、12.5、6.25 μg/L陽性對照組加阿霉素，其終質(zhì)量濃度為1.5 μg/L;陰性對照組加相同體積的RPMI1640培養(yǎng)液;藥物作用48 h后，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，用PBS洗1遍，加入胰酶細胞消化液消化，細胞消化后，加入收集的細胞培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，加入適量的TMRE，37℃ 孵育60 min.孵育結(jié)束后，1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS洗1遍，離心棄上清，用PBS重懸細胞后，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察線粒體膜電位熒光強度(FI)，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為540～570 nm.物鏡APO CS40×/1.25oil，zoom＞1，pinhole 1.5 Airy，掃描方式(mode)為XYZ，format 512×512，結(jié)果見圖1.

圖1 作用48 h細胞凋亡形態(tài)

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析進行組間t檢驗，結(jié)果以表示.

3 實驗結(jié)果

3.1 MTT法檢測藻紅蛋白對MCF-7細胞的生長抑制率

MTT法檢測結(jié)果顯示，用不同質(zhì)量濃度的藻紅蛋白培養(yǎng)細胞72 h后，可觀察到藻紅蛋白對MCF-7細胞的生長具有抑制作用，IC50為質(zhì)量濃度81.60μg/mL.200μg/mL的藻紅蛋白在作用于MCF-7細胞72 h后，抑制率最高為89.41%，見表1.

3.2 倒置顯微鏡細胞形態(tài)學(xué)觀察

陰性組細胞貼壁完好，輪廓清晰，沒有破裂，起皺.給藻紅蛋白各組隨給藥質(zhì)量濃度增加細胞生長密度逐漸變疏，表面起皺，高質(zhì)量濃度組大部分細胞破碎，細胞形態(tài)不完整，貼壁減少，見圖1.

表1 藻紅蛋白對MCF－7抑制作用

3.3 熒光顯微鏡觀察藻紅蛋白對MCF-7細胞形態(tài)學(xué)影響

Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，陰性對照組中MCF-7細胞染色質(zhì)均勻，核形態(tài)規(guī)則，陽性對照組中細胞呈現(xiàn)致密濃染熒光.藻紅蛋白給藥組MCF-7細胞形態(tài)呈現(xiàn)出細胞凋亡現(xiàn)象，中劑量組可見細胞核固縮且碎裂，高劑量組可見細胞核呈現(xiàn)濃染，見圖2.

圖2 作用48 h細胞凋亡形態(tài)

3.4 流式細胞儀測定藻紅蛋白誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡率

從圖3及表2中可以得出，PE對MFC-7作用48 h后，凋亡率隨著劑量逐漸增大，40μg/mL時調(diào)亡率為25.18%.60μg/mL時凋亡率為55.45%，160μg/mL時凋亡率達到83.94%.

圖3 藻紅蛋白誘導(dǎo)MFC－7細胞凋亡率

表2 流式細胞儀檢測Phycoerythrin對MCF－7細胞的凋亡率

3.5 激光共聚焦顯微鏡檢測MCF-7細胞中線粒體膜電位的變化

從表3中可得出，不同質(zhì)量濃度PE對MCF-7作用48 h后，線粒體膜電位熒光強度分別為24.40±0.21、20.45±0.24和19.77±0.27(空白組的膜電位為28.30±0.37);由此可知，PE可降低MCF-7細胞的線粒體膜電位，并且隨著PE劑量的增加，細胞內(nèi)線粒體膜電位減幅也相應(yīng)地增大，且與對照組相比都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).

表3 激光共聚焦顯微鏡檢測ΔΨm變化

4 討論

隨著對藻紅蛋白的深入研究，其藥理作用也越來越多的被發(fā)現(xiàn)，而藻紅蛋白在抗腫瘤方面的作用尤為突出.國內(nèi)外大多數(shù)研究都是圍繞藻紅蛋白作為光敏劑或者熒光探針應(yīng)用于腫瘤的治療中，而藻紅蛋白直接抗腫瘤的研究較少.近幾年來，才有關(guān)于藻紅蛋白粗提物直接抗腫瘤作用的報道.根據(jù)研究，藻紅蛋白粗提物能提高實驗小鼠機體抗突變、抗氧化和免疫能力.有研究表明，藻紅蛋白對人宮頸癌Hela細胞的生長有顯著的抑制作用并有明顯的劑量依賴關(guān)系.藻紅蛋白能將Hela細胞周期阻滯在G2/M期，抑制細胞增殖并誘導(dǎo)細胞調(diào)亡[4-5].

本實驗是研究不同劑量的藻紅蛋白對人乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制及凋亡作用，并通過檢測藻紅蛋白對細胞內(nèi)線粒體膜電位變化來研究藻紅蛋白是如何誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的.實驗中，MTT結(jié)果顯示藻紅蛋白對MCF-7細胞具有一定的細胞毒作用，且隨著龍藻紅蛋白質(zhì)量濃度的增大而抑制作用增強，其對MCF-7細胞的IC50值為81.60μg/mL.通過倒置顯微鏡觀察在藻紅蛋白直接作用人乳腺癌MCF-7細胞48 h后，陰性對照組細胞排列相對緊密，無細胞變形破碎，隨給藥濃度增加細胞生長密度逐漸變疏，細胞皺縮，高濃度組大部分細胞破碎，細胞形態(tài)不完整，貼壁減少.說明藻紅蛋白對MCF-7細胞是有凋亡作用的，并呈劑量依賴關(guān)系.Hoechst33258染色以后，熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈現(xiàn)均勻的藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核則呈現(xiàn)出致密濃染或為碎塊狀濃染熒光.本實驗結(jié)果提示，藻紅蛋白作用于MCF-7細胞48 h后細胞形態(tài)發(fā)生變化，隨著劑量增加出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，陰性對照組結(jié)果顯示MCF-7細胞染色質(zhì)均勻，核形態(tài)規(guī)則，中劑量給藥組細胞核出現(xiàn)碎片，高劑量給藥組細胞核則呈致密濃染，這表明藻紅蛋白可導(dǎo)致MCF-7細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變.本實驗利用碘化丙啶(PI)單染通過流式細胞儀檢測分析表明不同質(zhì)量濃度的藻紅蛋白作用MCF-7細胞48 h后，有明顯凋亡峰出現(xiàn)，各組細胞凋亡率由低劑量組25.18%到中劑量55.45%到高劑量83.94%隨著藥物質(zhì)量濃度增加而升高.進一步說明藻紅蛋白對MCF-7細胞的抑制作用與誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān).細胞凋亡的早期指標(biāo)之一就是線粒體跨膜電位變化，而貫穿線粒體內(nèi)膜和外膜的通道是PT孔[6-7].PT孔開放導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈與氧化磷酸化解偶聯(lián)、膜電位降低、ATP合成減少、還原性谷胱甘肽減少、細胞內(nèi)活性氧增多，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)膨脹，外膜皺襞少，表面積小，易于破裂，釋放出膜間促凋亡蛋白，最終引起細胞凋亡[8-9].本實驗通過激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化，不同質(zhì)量濃度PE對MCF-7作用48h后，線粒體膜電位熒光強度分別為24.40±0.21、20.45±0.24和19.77±0.27(空白組的膜電位為28.30±0.37);由此可知，PE可降低MCF-7細胞的線粒體膜電位，線粒體膜電位呈劑量性降低，因為線粒體膜電位是反映了線粒體功能的完整性，是評價線粒體功能的重要指標(biāo)，隨著給藥質(zhì)量濃度的增加，線粒體膜完整性被破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體膜電位的下降，最終細胞凋亡[10-11].

綜上所述，本研究提示藻紅蛋白對MCF-7細胞具有一定的細胞毒作用以及藻紅蛋白可降低MCF-7細胞內(nèi)線粒體膜電位，初步斷定藻紅蛋白可以誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡，但是通過何種凋亡途徑還有待進一步的研究.

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