于鶴丹，王政超，汪藹文，王建明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040)

抗風(fēng)濕涂膜劑是由辣椒和川烏的提取物，加入基質(zhì)殼寡糖，按制備工藝制成涂膜劑.其中辣椒主要活性成分為辣椒堿、二氫辣椒堿、降二氫辣椒堿[1]對風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、帶狀皰疹后遺神經(jīng)病、三叉神經(jīng)病等有顯著療效.發(fā)揮藥效的主要成分為其所含的生物堿類物質(zhì)，臨床上主要用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等癥.殼寡糖也稱幾丁寡糖，是將殼寡糖經(jīng)特殊的生物酶技術(shù)處理而得到的一種全新產(chǎn)品，其水溶性較好，功能作用大，而且由于其分子質(zhì)量低，具有較好的促透作用.本制劑選其作為基質(zhì)有利于藥物的釋放和吸收.

本實(shí)驗(yàn)研究旨在觀察辣椒素和烏頭總生物堿在涂膜劑中經(jīng)皮給藥后的體內(nèi)動態(tài)過程，以便為臨床用藥提供參考數(shù)據(jù)[2].

1 實(shí)驗(yàn)材料

動物:家兔(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心);儀器:Heraeus低溫高速離心機(jī)(德國);XW-80A漩渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Waters 600高效液相色譜儀及工作站(美國);C18色譜柱(迪馬公司4.6 mm×200 mm，5μm);756-PC紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);AG135電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，十萬分之一).

試劑:辣椒素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110839-200403);烏頭堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號720-9406);抗風(fēng)濕涂膜劑(課題組自制，批號:20110312);甲醇(色譜純);純凈水(娃哈哈食品有限公司);其余試劑均為分析純.

2 血藥質(zhì)量濃度測定方法

2.1 辣椒素HPLC檢測條件

固定相:C18色譜柱;流動相:甲醇-水(65∶35);檢測波長:280 nm;流速:1.0 mL/min，等度洗脫.

2.2 辣椒素樣品處理與測定

取家兔血清適量，加4倍量甲醇震振蕩混合30 s，以6 000 r/min離心20min，取上清液N2氣吹干，甲醇定容到2 mL，以0.45μL微孔濾膜濾過，即為辣椒素樣品溶液.精密吸取10μL進(jìn)樣，記錄峰面積積分值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出質(zhì)量比[3-4].

2.3 烏頭類總生物堿的檢測條件

用756-PC型紫外可見分光光度計(jì)于415 nm處測定吸光度.

2.4 烏頭類總生物堿樣品處理與測定

取家兔血清適量，加入pH值3.0的HAc-NaAc的緩沖液溶解4 mL，振蕩混合30 s，以6 000 r/min離心20 min，取上清液，N2吹干，溶解至250 mL容量瓶中，即為烏頭類總生物堿樣品溶液.

3 分析方法的確定

3.1 辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取辣椒素對照品約2.05 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.082 mg/mL的儲備液.精密吸取1 mL置于離心管中，加入家兔空白血漿1 mL，再加入甲醇4 mL，振蕩混合30 s，以6 000 r/min離心20 min取上清液N2吹干，甲醇定容至50 mL，以0.45μL微孔濾膜濾過，即為對照品溶液.取對照品溶液不同質(zhì)量濃度進(jìn)樣，記錄峰面積積分值[5-6]，以辣椒素的質(zhì)量濃度(μg/mL)對峰面積積分值回歸得線性方程為y=6462.4x-0.054 38，r=0.999 8，表明辣椒素的質(zhì)量比在1.64～164μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好.

3.2 辣椒素測定方法回收率考察

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，制備高、中、低3個質(zhì)量濃度的辣椒素血清樣品，并按照同樣方法進(jìn)行處理測定，重復(fù)5次，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程計(jì)算出的量為辣椒素的檢出量.辣椒素的檢出量與加入量的比值即為方法回收率.結(jié)果，加入對照品辣椒素12、24、36 mg平均回收率分別為101.46%、98.54%、99.28%，RSD(%)分別是4.59%、2.72%、4.68%.

3.3 辣椒精密度考察

取含血漿的辣椒素對照品溶液制成在高、中、低3個質(zhì)量濃度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定.

3.3.1 日內(nèi)精密度

取2.2項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液，一天之內(nèi)分別進(jìn)樣5次，以此面積計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD(%)分別是1.69%、3.53%、2.17%.

3.3.2 日間精密度

取2.2項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液，測定1次，連續(xù)測定5 d，以峰面積計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD(%)分別是2.39%、1.79%、4.35%.

3.4 辣椒穩(wěn)定性試驗(yàn)

取含辣椒素質(zhì)量濃度高的一組樣品，按2.2項(xiàng)下樣品處理與測定，分別放置0、2、6、8、12 h進(jìn)樣10μL，測定峰面積，得RSD(%)為1.30%，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定.

3.5 烏頭類總生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取烏頭堿對照品約1.9 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，以pH值3.0的HAc-NaAc的緩沖液溶解稀釋至刻度，精密吸取1 mL置于離心管中，家兔空白血漿1 mL，再分別加入pH值3.0的HAc-NaAc的緩沖液4 mL，振蕩混合30 s，以6 000 r/min離心20 min，取上清液，N2吹干，溶解至250mL容量瓶中，即為烏頭堿的對照品溶液.分別吸取不同質(zhì)量濃度的烏頭堿對照品溶液，分別置于干燥分液漏斗中，加入10mLpH值3.0的HAc-NaAc的緩沖液，再加入溴甲酚綠指示劑3 mL，充分振蕩，靜置10 min，用氯仿提取3次(各2、1、1 mL)，氯仿層過濾于5 mL容量瓶中定容，用756-PC型紫外可見分光光度計(jì)于415 nm處測定吸光度，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程A=0.079 33x-0.006(r=0.999 8)，表明烏頭堿的質(zhì)量比0.76～608μg之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系.

3.6 烏頭類總生物堿的回收率考察

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，制成高、中、低3個質(zhì)量濃度的烏頭類總生物堿血清樣品，并按照同樣方法進(jìn)行處理測定，重復(fù)5次，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、回歸方程計(jì)算出的量為烏頭類總生物堿的檢出量，烏頭類總生物堿的檢出量與加入量的比值即為方法回收率.結(jié)果，加入對照品烏頭類總生物堿50、75、100 mg，平均回收率分別是102.71%、96.33%、95.51%，RSD(%)分別是4.59%、4.41%、4.97%.

3.7 烏頭類總生物堿精密度考察

取含血漿的烏頭類總生物堿對照品溶液制成高、中、低3個質(zhì)量濃度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定.

3.7.1 日內(nèi)精密度

取2.4項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液，1 d之內(nèi)分別重復(fù)測定5次，以吸光度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD(%)分別是3.39%、3.18%、2.44%.

3.7.2 日間精密度

取2.4項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液，每天測定1次，連續(xù)測定5 d，RSD(%)分別是3.48%、3.90%、4.19%.

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取含烏頭類總生物堿質(zhì)量比高的一組樣品按“2.4”項(xiàng)下處理好的樣品，分別放置0、2、6、8、12 h，各取1 mL，按樣品處理方法測定吸光度，RSD(%)為4.90%，表明該方法穩(wěn)定.

4 試驗(yàn)方法與結(jié)果

4.1 實(shí)驗(yàn)方法

取家兔3只，試驗(yàn)前一天用脫毛劑在背部脫毛，實(shí)驗(yàn)時在背部涂抹抗風(fēng)濕涂膜劑，約為60 cm2(本制劑辣椒素質(zhì)量比約33.685 6 mg/g，烏頭類總生物堿質(zhì)量比約38.686 mg/g).在給藥后的0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、24 h，每個時間點(diǎn)分別于耳緣靜脈取血約2 mL，置于10 mL離心管中，6 000 r/min，離心20 min.取上清液N2吹干，加入恒定微量的甲醇，充分溶解，以0.45μL微孔濾膜濾過，按樣品處理與測定方法處理與測定，外標(biāo)峰面積法計(jì)算出辣椒素的血藥質(zhì)量濃度;另一份血清按烏頭類總生物堿的處理方法，計(jì)算出烏頭類總生物堿的血藥質(zhì)量濃度.

4.2 試驗(yàn)結(jié)果

4.2.1 辣椒素和烏頭類總生物堿的血藥質(zhì)量濃度

見表1及圖1.

表1 家兔涂抹抗風(fēng)濕涂膜劑后時間與血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)表(n=3)

圖1 家兔時間–血藥質(zhì)量濃度曲線圖

4.2.2 房室模型的選擇

通過血藥質(zhì)量濃度的均值作為主數(shù)據(jù)，采用3P97藥動學(xué)軟件進(jìn)行自擬數(shù)據(jù)處理.以理論血藥質(zhì)量濃度值與實(shí)驗(yàn)測得值相關(guān)系數(shù)最大和AIC最小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇最佳房室模型.結(jié)果辣椒素和烏頭類總生物堿均符合一室模型.

4.2.3 兩組數(shù)據(jù)處理結(jié)果

參數(shù)見表2、3.

表2 辣椒素的藥物動力學(xué)參數(shù)

表3 烏頭類總生物堿的藥物動力學(xué)參數(shù)

5 討論

本實(shí)驗(yàn)血漿樣品處理手段采取甲醇直接沉淀法沉淀蛋白，過濾膜后進(jìn)樣，方法簡便、快速.曾嘗試其他方法，回收率極低，且難以找到理想的內(nèi)標(biāo)物，這也是本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法的原因.用三氯醋酸、乙腈及高氯酸沉淀蛋白時，發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系和精密度均不好，故采用了甲醇直接沉淀蛋白的方法.

由于川烏中的川烏類總生物堿是由川烏堿、川烏總堿、川烏新堿等組成的，透皮吸收需要考察總生物堿的整體質(zhì)量比，所以采用紫外酸性染色比色法來測定川烏總生物堿的質(zhì)量比.因此考慮到分光光度法的靈敏度因而加大了家兔皮膚的涂抹劑量.同時其中的烏頭堿是需要控制質(zhì)量比的成分，此項(xiàng)研究已在質(zhì)量控制研究中進(jìn)行，此次未將此內(nèi)容列入.

本實(shí)驗(yàn)研究的藥動學(xué)數(shù)據(jù)表明本制劑中辣椒素在動物體內(nèi)吸收分布較快，代謝消除較慢;而烏頭類總生物堿吸收與代謝均較慢;且二者吸收程度均較好.前者吸收與分布較快而消除較慢提示止痛效果可以快速發(fā)揮并可持續(xù)較長的時間;而烏頭類總生物堿的吸收與消除均較慢提示其袪風(fēng)濕作用可以持續(xù)較長的時間且可緩解其毒性.

涂膜劑通過局部透皮給藥方式，使局部藥物質(zhì)量濃度提高，作用時間持久，有效地避免了腸道破壞及肝臟的首過效應(yīng)，提高了藥物的生物利用度和治療安全性，是一種比較理想的給藥方式.

[1]吳艷陽.陳開勛.邵計(jì)生.辣椒素的制備工藝及分析方法[J].化學(xué)世界，2004(4):218-221.

[2]趙 培，李文蘭，季宇彬，等.烏頭總生物堿貼片皮膚安全性的研究[J].食品與藥品，2007，9(8):14-17.

[3]王喜軍，張 寧，孫 暉，等.六味地黃丸的血清藥物化學(xué)研究[J].中國天然藥物，2004，4(2):219-222.

[4]趙 粼.魚油微丸的制備及其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[D].杭州:浙江大學(xué)，2005.

[5]王和平，張曉燕，王建明，等.肝復(fù)康滴丸中黃芩苷體內(nèi)藥物動力學(xué)的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，24(2):22-25.

[6]王建明，王政超.抗風(fēng)險涂膜劑的制劑研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，27(5):662-666.