季宇彬，孟凡影，曲中原，鄒 翔

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

白屈菜堿(chelidonine)是從罌粟科白屈菜屬植物白屈菜(Chelidonium majus L.)全草中提取分離出的苯并菲啶類生物堿[1]，是白屈菜的有效成分之一.目前發(fā)現(xiàn)它除了具有顯著的鎮(zhèn)痛作用外[2]，還對(duì)胃癌、白血病、鼻咽癌、肝癌有抑制作用[3].本文前期研究表明，白屈菜堿對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，并可將其阻滯于G2/M期.本文主要研究白屈菜堿對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞中Cdk1，p-Cdk1(Thr14)和cyclinB1蛋白表達(dá)的影響，探討白屈菜堿誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯的分子機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 腫瘤細(xì)胞株

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心藥物研究所博士后科研工作站傳代保種.

1.2 藥物與主要試劑

白屈菜堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，深圳美荷生物科技有限公司)，注射用硫酸長(zhǎng)春新堿(浙江海正藥業(yè)股份有限公司).RPMI 1640培養(yǎng)基及胰酶(美國(guó)Gibco公司).兔抗Cdk1/Cdc2多克隆抗體、兔抗p-Cdk1/Cdc2(Thr14)多克隆抗體(Bioworld生物技術(shù)有限公司)，兔抗cyclin B1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，堿磷酶標(biāo)記羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)研究所).

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(DL-CJ-1N醫(yī)用型)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(CO-150型)(美國(guó)NBS公司)，Adventurer萬分之一電子天平(OHAUS公司)，電泳儀(Bio-Rad公司)，垂直電泳轉(zhuǎn)印槽(北京六一儀器廠)，高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman-Coulter公司)，Tannon凝膠成像系統(tǒng)GIS-2019(Tannon公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901常規(guī)方法復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，相對(duì)濕度95%)培養(yǎng).0.25%胰酶消化傳代.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，設(shè)白屈菜堿給藥組白屈菜堿(終濃度為6.25、12.5、25μmol/L)，硫酸長(zhǎng)春新堿陽(yáng)性對(duì)照組(終濃度為5μmol/L)，陰性對(duì)照組(加相同體積的培養(yǎng)液RPMI 1640)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2 Western Blot法檢測(cè)白屈菜堿對(duì)SGC-7901細(xì)胞Cdk1，p-Cdk1(Thr14)和cyclinB1蛋白表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的白屈菜堿和陽(yáng)性對(duì)照藥，48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞.加細(xì)胞裂解液，于冰上裂解1.5 h，于4℃下12 000 r/min離心10 min，取離心后的上清，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量后，分裝轉(zhuǎn)移至離心管中放于-86℃保存?zhèn)溆?取蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到NC膜上，將一抗用5%脫脂奶粉稀釋，將膜與一抗置于封閉的塑料袋中在4℃冰箱中孵育過夜.過夜后，TBST緩沖液充分洗膜3次，每次振搖10 min，再與堿磷酶標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育2 h.沖洗未結(jié)合二抗，TBST搖洗3次，每次8 min.膜轉(zhuǎn)移至一淺托盤，室溫溫育，當(dāng)?shù)鞍讕ь伾疃冗_(dá)到要求(約20 min)，去離子水沖洗濾膜.濾紙包住保存，Tannon凝膠成像系統(tǒng)照相.掃描圖像在天能GIS凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行量化分析.

2.3 數(shù)據(jù)處理

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 16.0進(jìn)行One-Way ANOVA分析，結(jié)果以表示.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～3所示，白屈菜堿作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，可顯著下調(diào)Cdk1，cyclinB1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，同時(shí)顯著上調(diào)p-Cdk1(Thr14)蛋白的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01).

圖1 白屈菜堿對(duì)SGC－7901細(xì)胞Cdk1蛋白表達(dá)的影響

4 討論

大量實(shí)驗(yàn)表明，白屈菜堿對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞[4]、白血病L1210細(xì)胞[3]、人鼻咽癌KB細(xì)胞[5]等均有抑制作用，是一種潛在的腫瘤治療藥物，但其抗腫瘤活性可通過不同途徑介導(dǎo).本文前期研究發(fā)現(xiàn)，白屈菜堿可將人胃癌SGC-7901細(xì)胞阻滯于G2/M期.

在細(xì)胞周期中，細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDKs和細(xì)胞周期蛋白cyclins是主要的細(xì)胞周期調(diào)控分子，其中與G2/M期有關(guān)的是Cdk1和cyclinB1.Cdk1是G2/M期的關(guān)鍵蛋白，Cdk1的活化是細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期的必要條件[6]，Cdk1上的15位酪氨酸和14位蘇氨酸殘基使Cdk1高磷酸化，從而抑制了Cdk1的活性引起G2/M期阻滯.而cyclinB1是特異的G2/M期周期素，Cdk1與cyclinB1復(fù)合物的活化是啟動(dòng)有絲分裂的關(guān)鍵，同樣是G2期進(jìn)入M期的必要條件[6].而本文研究結(jié)果表明，白屈菜堿可顯著下調(diào)人胃癌SGC-7901細(xì)胞中Cdk1和cyclinB1蛋白的表達(dá)水平，這樣也直接導(dǎo)致了Cdk1和cyclinB1的復(fù)合物的減少[7].此外，白屈菜堿還可顯著上調(diào)人胃癌SGC-7901細(xì)胞中p-Cdk1(Thr14)蛋白的表達(dá)水平，表明白屈菜堿可使SGC-7901細(xì)胞大部分的Cdk1處于磷酸化狀態(tài)而不能活化，進(jìn)而將SGC-7901細(xì)胞住阻滯于G2/M期，但其更加深入的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究.

[1]黃 松，杜方麓.罌粟科白屈菜族的化學(xué)成分及植物化學(xué)分類依據(jù)的研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2002，10(8):582-584.

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[3]韋祖巧，鄒 翔，曲中原，等.白屈菜化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].中草藥，2009，40(S1):38-40.

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