張勤英，朱 凡，王毓明

(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院、蘇州市立醫(yī)院北區(qū)腫瘤內(nèi)科，江蘇蘇州215008)

近年來，有較強免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群受到廣泛關(guān)注。調(diào)節(jié)性T細胞 (regulatory T cell，Treg)作為一群具有免疫抑制效應(yīng)的T細胞亞群，在維持機體自身耐受和抑制自身免疫疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其中CD4+CD25highTreg等與腫瘤免疫逃逸有密切關(guān)系。本研究應(yīng)用流式細胞儀測定了36例結(jié)直腸癌患者及30名健康對照者外周血中CD4+CD25highTreg及其表面功能性標志分子細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原 －4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor forkhead box P3 protein，F(xiàn)oxP3)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2010年1月至2011年6月在我科住院接受治療的結(jié)直腸癌患者36例，男性20例，女性16例;年齡46～73歲，平均年齡(56.6±10.2)歲。所有患者均經(jīng)手術(shù)及術(shù)后病理確診，近1個月未接受抗腫瘤治療，近2個月未使用過免疫調(diào)節(jié)劑，無近期感染病史和自身免疫性疾病史。健康對照組為我院體檢中心提供的年齡、性別具有可比性的30例體檢健康者，男性17例，女性13例;年齡36～68歲，平均年齡(52.2 ±12.3)歲。

1.2 主要試劑 藻紅蛋白(PE)結(jié)合的CD4-PE單抗和異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD25-FITC單抗購自美國BD公司;葉綠素蛋白復合物(PerCP)結(jié)合的CTLA-4 PerCP、藻青蛋白標記(APC)FoxP3單抗及配套染色試劑均購自美國eBioscience公司;陰性對照采用的IgG2a-FITC、IgG1-PE和IgG-PerCP購自美國BD公司。

1.3 檢測方法 采集3 mL肘靜脈血，EDTA抗凝，以淋巴細胞分離液獲得單個核細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度為 1 × 107mL－1，取樣 100 μL，分別加入 10 μL CD25、10 μL CD4、5 μL CTLA-4 和 10 μL FoxP3 抗體，室溫下避光10 min，加溶血素2 mL后再避光10～15 min，根據(jù)紅細胞裂解狀態(tài)，以1 500 r·min－1離心5 min，棄上清液，加PBS液洗滌1次，再加200～500 μL PBS液混勻，上流式細胞儀檢測。對照管按同樣測定條件上機檢測。結(jié)果分析用FACSDIVA軟件。在前向角散射光－側(cè)向角散射光(FSC-SSC)散點圖上選定淋巴細胞群，以CD4+和SSC設(shè)門，選擇CD4+T細胞分析門內(nèi)相關(guān)Treg細胞亞群。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

流式細胞儀分別檢測CD4+T細胞、CD4+CD25highTreg、CD4+CD25highFoxP3 Treg 和 CD4+CTLA-4 Treg。R1為淋巴細胞散點圖(圖1)，CD4+T細胞以R1設(shè)門，CD4+CD25highTreg以 CD4+設(shè)門，CD4+CD25highFoxP3 Treg和CD4+CTLA-4 Treg均以CD4+CD25high設(shè)門(圖2)。與健康對照組比較，結(jié)直腸癌組患者外周血CD4+CD25+FoxP3 Treg顯著增多(P ＜0.01)，CD4+CD25highTreg和 CD4+CTLA-4 Treg增多(P ＜0.05)，CD4+T細胞減少(P＜0.05)。見表1。

表1 各組外周血不同T細胞水平的測定結(jié)果

3 討論

在生理狀態(tài)下，機體免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視作用，能有效防止腫瘤的發(fā)生。在腫瘤患者中免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的反應(yīng)明顯下降，不能有效限制、清除腫瘤細胞，這與腫瘤的形成有密切關(guān)系。目前認為這種對腫瘤抗原弱免疫應(yīng)答的原因可能是腫瘤抗原為變異的自身抗原或機體免疫功能下調(diào)，即免疫穩(wěn)態(tài)破壞。

Treg作為具有免疫抑制效應(yīng)的T細胞亞群，能特異性抑制T細胞對外源性和自體抗原的免疫反應(yīng)，因此在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止機體對自體同源腫瘤細胞的免疫。CD4+CD25+Treg為具有獨立功能的T細胞亞群，在免疫抑制機制和維持自身免疫耐受過程中具有十分重要的作用，在一些腫瘤的研究中，已證明了CD4+CD25+Treg可以抑制體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)［1］。

CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的5% ～10%，具有免疫調(diào)節(jié)活性的細胞主要是高表達CD25+的細胞，即CD4+CD25highTreg。結(jié)直腸癌患者Treg介導的免疫耐受和腫瘤的生長密切相關(guān)，Treg可能直接參與腫瘤的發(fā)生過程，也可以提示惡性腫瘤的預后。本研究結(jié)果顯示，36例結(jié)直腸癌患者外周血CD4+CD25highTreg增加，提示結(jié)直腸癌患者免疫功能失調(diào)與其外周血Treg比例增加有關(guān)，在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中CD4+CD25highTreg可能起著重要的作用。

腫瘤局部Treg數(shù)量升高的原因主要為:1)腫瘤抗原和趨化因子作用使得天然CD4+CD25highTreg在腫瘤局部募集和擴增，LAGE1和ARTC1等腫瘤抗原刺激其活化增殖，導致腫瘤部位腫瘤抗原特異性CD4+CD25highTreg比例增加;2)TCR刺激和TGF-β聯(lián)合作用誘導FoxP3在CD4+CD25highT細胞中的表達，導致其轉(zhuǎn)變成具有調(diào)節(jié)活性的CD4+CD25highTreg［2］。

CTLA-4是一種抑制性調(diào)節(jié)分子，其編碼基因位于人類2號染色體q33區(qū)，表達受到嚴密調(diào)控。除靜止T細胞外，已活化的T細胞、Treg的一些亞群和Th細胞中均存在CTLA-4。CTIA-4與CD28競爭性結(jié)合配體，在T細胞的活化反應(yīng)中發(fā)揮著負性調(diào)節(jié)作用。CTLA-4和B7的結(jié)合導致細胞活化和增殖信號的下調(diào)，IL-2的合成也被抑制。CTLA-4能與 CD80和CD86結(jié)合，向T細胞發(fā)出抑制信號，使活化T細胞的子代細胞對抗原刺激的敏感性降低，從而發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，一類具有免疫抑制效應(yīng)的FoxP3+Treg在腫瘤局部募集、擴增，通過細胞與細胞間接觸的方式和分泌調(diào)節(jié)性細胞因子IL-10、TGF-β等的方式抑制CD4+和CD8+T細胞的分化和增殖，從而抑制 T細胞抗腫瘤免疫效應(yīng)，促進腫瘤生長［3］。FoxP3并非細胞活化的標記，而是Treg內(nèi)的標記分子，該蛋白的表達對CD4+CD25+Treg的發(fā)育成熟、功能發(fā)揮等方面均具有重要作用，也是目前CD4+CD25+Treg最敏感的標記，其作為特異性表達于 CD4+CD25+Treg表面的一種轉(zhuǎn)錄因子，有別于CD25、CTLA-4等，逐漸成為目前公認的CD4+CD25+Treg特異性的標記［4－5］。FoxP3 不但限制了特異性表達的CD4+CD25highTreg，而且對這些細胞調(diào)節(jié)功能的誘導起關(guān)鍵作用。將FoxP3基因?qū)隒D4+CD25+Treg，這些細胞受刺激時就表現(xiàn)出與自然產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg的無能或抑制表型，也能在體外抑制T細胞的免疫應(yīng)答。因此，F(xiàn)oxP3在CD4+CD25+Treg的發(fā)育和功能發(fā)揮上是必需的。通過檢測CD4+CD25highTreg百分數(shù)及其功能性標志分子FoxP3和CTLA-4可以較全面地反映CD4+CD25highTreg的數(shù)量和功能狀況。

近年來，結(jié)直腸癌免疫治療有了很大的發(fā)展，主要方法除了傳統(tǒng)的非特異性主動免疫治療外，還有特異性主動免疫治療、免疫基因治療、被動性免疫反應(yīng)、靶向治療等［6］。如表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)的表達在結(jié)直腸癌組織中明顯高于正常結(jié)直腸黏膜及良性病變組織;隨不典型增生的加重，EGFR表達增加。如果對于EGFR依賴性或部分依賴性的結(jié)直腸癌患者選擇以EGFR為靶點的抗腫瘤治療，患者的生存質(zhì)量會大大提高［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者外周血中CD4+CD25highFoxP3 Treg增高，這表明CD4+CD25highFoxP3 Treg的變化較CD4+CD25highTreg及 CD4+CTLA-4 Treg更為敏感。檢測CD4+CD25highFoxP3 Treg可進一步了解結(jié)直腸癌患者體內(nèi)免疫狀態(tài)和疾病活動性，這些發(fā)現(xiàn)為腫瘤的靶向免疫治療提供了依據(jù)。免疫調(diào)節(jié)藥物的出現(xiàn)代表了腸道惡性腫瘤及其他惡性腫瘤免疫治療的方向。某些藥物，如自體腫瘤細胞疫苗、重組CEA疫苗等已進入臨床研究。然而，本研究病例數(shù)較少，不能排除抽樣誤差，尚需擴大樣本量進一步研究。

［1］許浪，王育斌，劉丹，等.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞及其相關(guān)基因FoxP3在非小細胞肺癌患者外周血中的變化［J］.中國醫(yī)藥導報，2009，6(7):23－25.

［2］張利寧.調(diào)節(jié)性T細胞與腫瘤［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(3):201－205.

［3］陶學芳，李和權(quán)，周建英，等.FoxP3、CD3在非小細胞肺癌組織中的表達及意義［J］.浙江醫(yī)學，2010，32(1):46 －48，51.

［4］Sakaguchi S.Naturally arising FoxP3-expressing CD25+CD4+regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self［J］.Nat Immunol，2005，6(4):345－352.

［5］Williams LM，Rudensky AY.Maintenance of the FoxP3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of FoxP3［J］.Nat Immunol，2007，8(3):277 － 284.

［6］李天煜，陳利生.結(jié)直腸癌的免疫逃逸與免疫治療進展［J］.結(jié)直腸肛門外科，2008，14(4):288 －291.

［7］劉偉東，趙巧艷，毋永娟.EGFR在結(jié)直腸癌組織中表達的意義［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2010，23(6):275 －276.