孫琳林 丁良菊 任巖海 劉倫翠 盧 林

1.牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院中西醫(yī)結合科，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院腦外科，黑龍江牡丹江 157011

隨著世界性人口老齡化問題的日益突顯，抗衰老研究已成為醫(yī)學研究中的熱點之一。左歸丸與六味地黃丸均是滋補腎陰的經典名方，現代研究發(fā)現兩方均有延緩衰老的藥理作用。左歸丸是張景岳根據六味地黃丸加減化裁而成，前者純甘壯水，補而不瀉，后者以補為主，補瀉兼顧。本研究在前期相關實驗的基礎上，觀察了左歸丸、六味地黃丸及兩方共有“三補”藥物組對D-半乳糖（D-gal）致衰老模型大鼠三磷酸腺苷酶（ATPase）及凋亡因子Bcl-2和Bax表達的影響，探討了兩補陰方對衰老模型大鼠的細胞鈣穩(wěn)態(tài)、膜穩(wěn)定性和細胞凋亡的調節(jié)作用，從補瀉不同配伍方式的角度對兩方抗衰作用進行分析和比較。

1 材料與方法

1.1 用藥及制備

左歸丸（熟地 24 g、山藥 12 g、山萸肉 12 g、枸杞 12 g、牛膝9 g、菟絲子12 g、龜板膠12 g和鹿角膠 12 g）、六味地黃丸（熟地 24 g、山藥 12 g、山萸肉 12 g、茯苓 9 g、牡丹皮 9 g和澤瀉9 g）及“三補”藥物組（熟地24 g、山藥12 g和山萸肉12 g）。中藥飲片購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，左歸丸煎制后濃度為6.3 g/mL，六味地黃丸煎制后濃度為4.5 g/mL，“三補”藥物組煎制后濃度為2.88 g/mL，4℃冷藏保存。

1.2 動物及分組

取 Wistar大鼠 60 只，雌雄各半，體重（300±20）g，體重區(qū)域化后隨機分為正常組、模型組、六味組、三補組和左歸組，每組12只。

1.3 造模及給藥

選用D-半乳糖致亞急性衰老模型[1]。將D-gal 5 000 mg溶于生理鹽水500 mL中，配成10 mg/mL濃度的溶液，按125 mg/（kg·d）劑量給大鼠腹腔注射，正常組注射等體積生理鹽水，造模周期為8周。左歸組、六味組和三補組造模開始的同時按10 mL/kg每日上午分別給予相應治療藥物，正常組和模型組給予生理鹽水，每日1次。左歸組、六味組和三補組的模型大鼠每日灌服劑量分別為31.5、22.5和14.4 g/kg，給藥周期為8周。8周后各組大鼠取肝、腦組織進行組織勻漿和固定，腦組織固定后剝離海馬區(qū)，按要求保存，待測。

1.4 指標及檢測

觀察指標包括：肝、腦組織中的ATPase活力和腦海馬區(qū)的Bcl-2和Bax蛋白表達。測定ATPase試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，Bcl-2和Bax免疫組化試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，所有指標檢測均按照實際說明進行，免疫組化以酶標抗體法染色DAB顯色劑顯色后，采用Motic Med 6.0彩色病理圖像分析系統進行分析和計數。

1.5 統計學方法

實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組對細胞膜三磷酸腺苷酶活力的作用

實驗動物ATPase活力在模型組明顯低于正常組，差異有高度統計學意義（P<0.01）；各給藥組中，六味組和三補組對肝、腦細胞膜的Na+-K+-ATPase和肝細胞膜的Ca2+-Mg2+-ATPase活力的提升作用與模型組比較差異有統計學意義（P<0.01或P<0.05），但其對腦細胞膜中的Ca2+-Mg2+-ATPase活力的提升作用與模型組比差異無統計學意義 （P>0.05），左歸組對肝、腦細胞膜的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力提升作用模型組差異均有統計學意義（P<0.01或P<0.05），三給藥組之間差異無統計學意義。見表1、2。

表1 各組對肝細胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

表1 各組對肝細胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數 Na+-K+-ATPase（U/mg prot）Ca2+-Mg2+-ATPase（U/mg prot）正常組模型組六味組三補組左歸組12 12 12 12 12 2.53±0.49**0.78±0.36 1.62±0.57**1.58±0.52**1.65±0.54**2.02±0.73**0.92±0.47 2.26±1.00**1.50±0.56*1.61±0.60*

2.2 各組對腦海馬區(qū)Bcl-2和Bax的作用

根據表3可以看出，模型組動物腦海馬區(qū)的Bax蛋白表達比正常組顯著升高，Bcl-2顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；三個給藥組動物的腦海馬區(qū)Bcl-2表達顯著上調，Bax表達顯著下調，相較于模型組差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）（圖1～10），各給藥組之間差異無統計學意義。

3 討論

D-gal 造成亞急性衰老模型的機制在于其引起的糖代謝紊亂能使生物體產生大量自由基，大量的自由基又能導致生物體出現多種由氧自由基介導的損傷效應，這些損傷累積到一定程度即引起亞急性衰老的發(fā)生。在這一過程中，Ca2+-Mg2+-ATPase的巰基蛋白基團可被氧自由基氧化，使其活性下降；同時脂質過氧化的發(fā)生還能引起細胞膜的流動性的改變，從而對酶的集聚造成影響[2]。自由基引起的氧化損傷還包括細胞毒反應，這種損傷不可逆，會導致細胞凋亡的發(fā)生。據報道自由基尤其是活性氧自由基（ROS）是調節(jié)細胞凋亡的重要因素之一，如砷劑誘導細胞凋亡就是通過提高細胞中ROS的含量來實現的[3]。ATPase是細胞膜上負責細胞內外離子平衡的一種膜酶，它能將細胞內的鈣泵到細胞外，從而使細胞持續(xù)處于細胞內鈣低濃度而胞外高濃度的狀態(tài)，我們稱之為“鈣穩(wěn)態(tài)”。正常情況下，ATPase會隨著年齡的增加而活性下降，引起神經細胞內游離鈣濃度增加，出現鈣穩(wěn)態(tài)的失調，細胞內鈣超載，加速細胞的衰老[4]。因此，提高ATPase活性，促進維持細胞的鈣穩(wěn)態(tài)，可以在一定程度上延緩衰老。細胞凋亡可以由包括自由基在內的多種因素誘發(fā)產生，Bcl-2的過度表達可有效阻止細胞凋亡的發(fā)生。Bax與之相反，其主要作用是加速細胞凋亡。Bax在凋亡發(fā)生過程中不但能和Bcl-2形成異源二聚體（Bcl-2-Bax，heterodimer）而起到抑制凋亡的作用，還能自身形成同源二聚體（Bax-Bax，homodimer）而誘導凋亡[5]。

表2 各組對腦細胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

表2 各組對腦細胞膜三磷酸腺苷酶活性的影響作用（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數 Na+-K+-ATPase（U/mgprot）Ca2+-Mg2+-ATPase（U/mgprot）正常組模型組六味組三補組左歸組12 12 12 12 12 11.7±3.04**2.59±1.68 4.38±2.09*5.54±2.86**7.01±3.03**7.29±2.61**2.72±1.30 3.04±1.45 3.16±1.89 4.43±1.37*

表3 各組對衰老大鼠腦海馬區(qū)Bcl-2和Bax表達的影響（±s）

表3 各組對衰老大鼠腦海馬區(qū)Bcl-2和Bax表達的影響（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數 Bcl-2 Bax正常組模型組六味組三補組左歸組12 12 12 12 12 165.1±2.26*69.4±3.43 185.7±5.02**170.2±3.07*173.4±3.13*168.1±3.62**185.9±4.90 173.9±4.05**179.3±3.09**173.1±3.12**

中醫(yī)學認為衰老的內因在于腎中陰精的虧損，如《素問·陰陽應象大論》中記載：“年四十，而陰氣自半也，起居衰矣”，朱丹溪在《養(yǎng)老論》一文中亦提出：“人身之陰，難成易虧，六七十后，陰不足以配陽，孤陽幾欲飛越”，可見補腎填精可以延緩衰老?，F代大量的藥理研究已發(fā)現，具有補腎填精作用的中藥復方可以通過影響細胞周期而發(fā)揮減緩細胞衰老的作用[6]。左歸丸與六味地黃丸均有滋腎陰、補腎精的作用，是公認的抗衰古方，從配伍上看，補腎填精的“三補”是兩方共有的并且在方中起主要治療作用的部分。本實驗結果發(fā)現，D-半乳糖可以使ATPase活性降低，Bcl-2和Bax蛋白表達明顯上調，給予三組中藥干預后ATPase活性提高、抑制凋亡因子Bcl-2應激性的表達上調、加速凋亡因子Bax出現表達下調，說明左歸丸與六味地黃丸的抗衰老作用可能與促進維持細胞膜的穩(wěn)定性和鈣穩(wěn)態(tài)狀態(tài)以及抑制細胞凋亡有關，兩方共有的“三補”藥物組亦具有相同的藥理作用。兩補陰方盡管存在補瀉配伍方法上的不同，但在本研究中未出現顯著性藥理作用差異，提示“三補”在兩方中發(fā)揮了優(yōu)勢性作用。

[1]徐叔云，卞如濂.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1464-1466.

[2]張偉，張艷淑，姚林，等.Oncolyn對衰老小鼠腦組織中ATP酶活性和神經生長因子的表達的影響[J].衛(wèi)生研究，2007，36（2）：164-166.

[3]Nystrom T.The free-radical hypothesis of aginggoes prokaryotic[J].Cell Mol Life Sci，2003，60（7）：1333-1341.

[4]Guoyuan Y，Chen Sylvia F，Kinouchi H，et al.Edema cation content and ATPase activity after middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke，1992，23（9）：1331-1336.

[5]Guan QH，Pei DS，Xu TL，et al.Brain ischem in reperfusion-induced expression of DP5 and interaction with Bcl-2，thus freeing Bax from Bcl-2/Bax dimmers are mediated by c-Jun N-terminal kinase（JNK）pathway[J].Neurosci Lett，2006，393：226-236.

[6]胡兵，安紅梅，史云峰，等.補腎填精復方對WI38細胞周期及相關基因表達的影響[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2007，30（2）：35-38.