余 濤，李良慶，王家興，于錫陽，栗大偉

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科一區(qū)，福建福州350004)

胃癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，尤其是在東亞和東南亞，包括中國在內(nèi)［1］。每年我國因胃癌死亡的人數(shù)占各種惡性腫瘤之首，傳統(tǒng)手術及術后化療對進展期胃癌的治療仍不理想，近年來，隨著對腫瘤分子生物學研究的不斷深入，針對腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期等的研究逐漸成為抗腫瘤治療的重點和熱點。環(huán)氧合酶－2(cyclooxygenase-2，COX-2)作為新型腫瘤標志物，在多種人類腫瘤中過度表達，在腫瘤的進展中，COX-2參與了許多病理生理過程，包括細胞的增殖、凋亡、調(diào)節(jié)免疫和血管生成［2－3］。近年來選擇性COX-2抑制劑，在抗腫瘤通路中受到國內(nèi)外學者的廣泛關注，本實驗通過MTT、免疫組化、ELISA、流式細胞儀觀察選擇性COX-2抑制劑NS-398在體外對胃癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑 人胃癌SGC-7901細胞株購自南京凱基生物技術有限公司。NS-398購自美國Sigma公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司;胰蛋白酶、RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;前列腺素－E2(prostaglandin E2，PGE2)酶聯(lián)免疫測定試劑購自江蘇碧云天生物技術研究所;Alexa Fluor 488Annxin V/PI試劑盒購自Invitrogen公司。COX-2免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SGC-7901細胞置于37℃，體積分數(shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含體積分數(shù)10%滅活胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基，當細胞呈對數(shù)增殖并覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底80%面積時可用于傳代或實驗。

1.2.2 MTT法測定NS-398對SGC-7901細胞的抑制率 取對數(shù)期生長的SGC-7901細胞，制備單細胞懸液，以每孔1.0×104個細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后。換 NS-398 濃度分別為 50、100、200 μmol·L－1的含體積分數(shù)10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基，其中設空白對照組，即未加藥的培養(yǎng)基，每種濃度設6個復孔，分別培養(yǎng) 24、48、72 h后，再向每孔加 MTT(5 g·L－1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸去原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩 10 min;用酶標儀(波長 490 nm)測定每個孔的吸光度(OD)值，按下列公式計算細胞抑制率，抑制率=(1－實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.2.3 免疫組化方法檢測COX-2蛋白的表達 取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種于含蓋玻片的6孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，換NS-398濃度分別為50、100、200 μmol·L－1的含體積分數(shù) 10%胎牛血清 RMPI-1640培養(yǎng)基并設實驗空白對照組，即不含NS-398的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出玻片，PBS沖洗數(shù)次，體積分數(shù)4%的多聚甲醛固定。COX-2免疫細胞化學染色，操作按試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作為陰性對照組，用無NS-398干預組作為陽性對照組。判斷標準:將不同濃度處理組重復40次，每張玻片置于光學顯微鏡下，隨機計數(shù)1 000個細胞(獨立高倍視野)中的陽性細胞數(shù)，用 Gatalica等［4］的半定量分析法，即對每張切片的陽性細胞率及陽性細胞著色強度分別進行分級計分，然后根據(jù)2項乘積確定其陽性強度。將染色強度分為4級:無染色為0分，弱染色1分，中等染色2分，強染色3分，陽性細胞百分率:＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～75%為2分，＞75%為3分;然后進行組織評分(H)=染色強度計分(I)×陽性細胞百分率計分(P)，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，＞6分為強陽性(+++)。本研究以陽性及強陽性記為陽性數(shù)據(jù)，以陰性及弱陽性記為陰性數(shù)據(jù)。

1.2.4 ELISA法測定SGC-7901細胞釋放的 PGE2將呈對數(shù)生長期的SGC-7901細胞制成單細胞懸液，以每孔1×105個的密度接種于24孔板，每孔1 mL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液分組加藥物。實驗組NS-398 濃度分別為 50、100、200 μmol·L－1，對照組加培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后分別收集上清，存于－20℃中備用。取上述細胞培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書進行測定PGE2。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 選對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化成單細胞懸液后，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為每孔1×105個，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1.5 mL。細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液分組加藥物。實驗組NS-398濃度分別為50、100、200 μmol·L－1，對照組加培養(yǎng)液。培養(yǎng) 48 h 后分別收集每孔細胞，再經(jīng)預冷的PBS洗3次，按Alexa Fluor 488Annxin V/PI試劑盒提供的方法依次加入結合緩沖液、Alexa Fluor 488Annxin V和PI，常溫避光15～30 min后經(jīng)流式細胞儀檢測并讀取細胞凋亡率。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示。對符合正態(tài)分布的計量資料采用方差分析，多組間指標的比較均采用單因素方差分析，LSD-t及SNK-q檢驗。細胞染色結果比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 NS-398對SGC-7901細胞生長抑制曲線 NS-398以時間劑量依賴性方式抑制SGC-7901細胞的生長，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，不同濃度的NS-398作用24、48、72 h后細胞抑制率均逐漸上升(P＜0.05)。見表1。

表1 不同濃度NS-398在不同時間對SGC-7901細胞的抑制率 %

2.2 NS-398對SGC-7901細胞COX-2蛋白的表達COX-2免疫陽性染色在光鏡下表現(xiàn)為胞漿和胞核呈棕黃色顆粒，陰性細胞表現(xiàn)為胞漿和胞核未見明顯棕黃色染色顆粒。結果顯示:COX-2在SGC-7901細胞的胞漿及胞核中成高表達，陽性表達率為95.03%;經(jīng)50、100、200 μmol·L－1的 NS-398 作用 48 h 后的 SGC-7901細胞COX-2蛋白表達明顯減弱，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);隨著NS-398濃度的增加，COX-2蛋白表達呈下降趨勢，且實驗組間差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2、3，圖1。

表2 不同濃度NS-398作用于SGC-7901細胞48 h后COX-2蛋白的表達

表3 不同濃度NS-398作用于SGC-7901細胞48 h后的COX-2蛋白表達率

2.3 NS-398作用SGC-7901細胞后PGE2的檢測結果 NS-398可明顯抑制PGE2的釋放，且呈劑量依賴效應，0、50、100、200 μmol·L－1的 NS-398 作用 SGC-7901細胞48 h后，PGE2的釋放量呈下調(diào)趨勢，實驗組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各實驗組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 不同濃度的NS-398作用于SGC-7901細胞后PGE2表達

2.4 細胞凋亡率檢測 0、50、100、200 μmol·L－1的NS-398作用SGC-7901細胞48 h后，SGC-7901細胞的凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著藥物濃度的增加，凋亡率呈上調(diào)趨勢，且各實驗組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表5。

表5 不同濃度的NS-398對SGC-7901細胞凋亡的影響

3 討論

COX-2是花生四烯酸/前列腺素代謝中的一個關鍵限速酶，與COX-1不同，COX-2在人體為誘導性酶，在生理狀態(tài)下靜息組織內(nèi)不表達，而在致炎因子、損傷、生長因子、致瘤因子等作用下可誘導其迅速表達。近年來，越來越多研究［5－6］發(fā)現(xiàn) COX-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中產(chǎn)生重要作用，許多惡性腫瘤內(nèi)都能檢測到COX-2的高表達，如乳腺癌、肺癌、大腸癌和鼻咽癌等。研究表明，在胃癌細胞中COX-2也存在高表達，且其表達程度與胃癌預后密切相關［7］。本實驗研究也證明COX-2在胃癌細胞中存在高表達，提示，COX-2可能與胃癌的發(fā)生存在相關性，研究發(fā)現(xiàn)COX-2的高表達不僅代表腫瘤的早期事件，且與腫瘤的浸潤程度、淋巴結轉移、TNM分期及患者的預后密切相關［8－9］。目前認為COX-2的致腫瘤機制包括:誘導腫瘤血管生成、抑制腫瘤凋亡、增加腫瘤發(fā)生和侵襲的能力、免疫抑制等［10－11］。

前列腺素作為第二信使，與其受體結合，可發(fā)揮多種生物學效應。如促進細胞的增殖、誘導血管的生成、刺激腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的凋亡等。COX-2的高表達增加了PGE2的合成，PGE2可抑制樹突狀細胞成熟，抑制CD8+T細胞的活性，抑制人白細胞抗原Ⅰ和Ⅱ的表達，從而減少機體免疫系統(tǒng)對突變細胞的免疫監(jiān)視作用［12］，此外，PGE2可誘導Bcl-2的表達，后者參與了內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體凋亡途徑)，可阻止細胞色素C從線粒體向胞漿釋放，而該環(huán)節(jié)位于半胱氨酸蛋白酶caspase級聯(lián)反應上游［13］，因此阻斷了內(nèi)源性凋亡途徑，導致細胞在增殖與凋亡中失衡，從而導致腫瘤的產(chǎn)生。理論上可通過抑制COX-2的表達而使PGE2的產(chǎn)生減少，從而誘導腫瘤細胞凋亡。

由于COX-2致癌途徑成為了許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展及抗凋亡重要途徑，因此作者推測COX-2可能成為腫瘤靶向治療的很好位點，這促使研究選擇性COX-2抑制劑抑制腫瘤細胞生長的可能性。

本研究主要觀察選擇性COX-2抑制劑NS-398對SGC-7901細胞株的增殖、凋亡的影響，并初步探討其可能的機制。MTT、流式細胞儀檢測實驗結果顯示，NS-398對SGC-7901細胞具有明顯的抑制、促凋亡作用，并呈現(xiàn)良好的時間和劑量雙效依賴性，作者推測可能與NS-398通過對COX-2的抑制作用而活化誘導凋亡信號caspase-3活性、抑制Bcl-2的表達、提升介導凋亡的轉化生長因子TGFβ2受體水平以及抑制抗凋亡關鍵激酶Akt活性相關。免疫組化、ELISA法檢測結果顯示，COX-2在SGC-7901細胞株中呈現(xiàn)高表達，PGE2在SGC-7901存在高釋放量，這與國內(nèi)外許多學者研究結果一致［14－15］，經(jīng) NS-398作用48 h后 COX-2的表達量明顯減少、PGE2的釋放呈下調(diào)趨勢，并呈劑量依賴性，同時細胞凋亡水平上升。作者推測可能與抑制COX-2-PGE2依賴途徑，抑制Bcl-2的表達，阻斷內(nèi)源性凋亡途徑相關。因此本研究結果證實選擇性COX-2抑制劑NS-398在體外可通過COX-2依賴途徑，誘導胃癌細胞凋亡，抑制胃癌細胞增殖，這為COX-2抑制劑有可能用于胃癌的預防和治療提供了一定的實驗理論依據(jù)。

［1］Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74 －108.

［2］Rudnick DA，Perlmutter DH，Muglia LJ.Prostaglandins are required for CREB activation and cellular proliferation during liver regeneration［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(15):8885－8890.

［3］Ozuysal S，Bilgin T，Ozgur T，et al.Expression of cyclooxygenase-2 in ovarian serous carcinoma:correlation with angiogenesis，nm23 expression and survival［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2009，30(6):640－645.

［4］Gatalica Z，Lele SM，Rampy BA，et al.The expression of Fhit protein is related inversely to disease progression in patients with breast carcinoma［J］.Cancer，2000，88(6):1378 －1383.

［5］Greenhough A，Smartt HJ，Moore AE，et al.The COX-2/PGE2 pathway:key roles in the hallmarks of cancer and adaptation to the tumour microenvironment［J］.Carcinogenesis，2009，30(3):377－386.

［6］Ghosh N，Chaki R，Mandal V，et al.COX-2 as a target for cancer chemotherapy［J］.Pharmacol Rep，2010，62(2):233 － 244.

［7］Shin VY，Jin HC，Ng EK，et al.Nicotine and 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone induce cyclooxygenase-2 activity in human gastric cancer cells:Involvement of nicotinic acetylcholine receptor(nAChR)and beta-adrenergic receptor signaling pathways［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2008 ，233(2):254 －261.

［8］蔡鳳林，周士福，馬兆生 ，等.乳腺浸潤性導管癌中COX-2、MMP-2的表達及其相關性［J］.實用癌癥雜志，2008，23(1):44－47.

［9］Pan J，Kong L，Lin S，et al.The clinical significance of coexpression of cyclooxygenases-2，vascular endothelial growth factors，and epidermal growth factor receptor in nasopharyngeal carcinoma［J］.Laryngoscope，2008，118(11):1970 －1975.

［10］Legan M，Luzar B，F(xiàn)erlan-Marolt V，et al.Cyclooxygenase-2 expression determines neo-angiogenesis in gallbladder carcinomas［J］.Bosn J Basic Med Sci，2006，6(4):58 －63.

［11］Lang S，Picu A，Hofmann T，et al.COX-inhibitors relieve the immunosuppressive effect of tumor cells and improve functions of immune effectors［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2006，19(2):409－419.

［12］Chen TH，F(xiàn)ukuhara K，Mandai M，et al.Increased cyclooxygenase-2 expression is correlated with suppressed antitumor immunity in cervical adenocarcinomas［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16(2):772－779.

［13］Fosslien E.Molecular pathology of cyclooxygenase-2 in neoplasia［J］.Ann Clin Lab Sci，2000，30(1):3 －21.

［14］Kuo CH，Hu HM，Tsai PY，et al.Short-term celecoxib intervention is a safe and effective chemopreventive for gastric carcinogenesis based on a mongolian gerbil model short-term celecoxib intervention is a safe and effective chemopreventive for gastric carcinogenesis based on a Mongolian gerbil model［J］.World J Gastroenterol，2009 ，15(39):4907－4914.

［15］Wei M，Morimura K，Wanibuchi H，et al.Chemopreventive effect of JTE-522，a selective cyclooxygenase-2 inhibitor，on 1，2-dimethylhydrazine-induced rat colon carcinogenesis［J］.Cancer Lett，2003，202(1):11－16.