孫啟強(qiáng)，蘭 斌，陳彥超

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，福建福州350005)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，隨著居民飲食結(jié)構(gòu)、生活環(huán)境的改變及診斷水平的提高，其檢出率有逐年升高的趨勢。增殖細(xì)胞核抗原67(proliferating cell nuclear antigen 67，Ki-67)和胸苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)在多種腫瘤組織中都有表達(dá)，兩者與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展等生物學(xué)行為均有密切關(guān)系，本文通過對(duì)胃癌、正常胃組織中兩者表達(dá)的比較研究，探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009年至2011年手術(shù)切除、術(shù)后病理證實(shí)為胃癌的標(biāo)本71例，其中男性53例，女性18例;平均年齡61歲;全部患者術(shù)前均未接受過放化療。組織學(xué)分型:高、中分化腺癌30例，低、未分化腺癌41例;浸潤深度:黏膜層及肌層23例，達(dá)到或穿透漿膜層48例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期52例。另隨機(jī)抽取門診胃鏡檢查正常胃組織標(biāo)本20例作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 TK1鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào)F12，稀釋度1∶400，購自 Abnova 公司;Ki-67，鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào)MB1，稀釋度1∶200，購自中山金橋公司;二抗(Envision 2步法鼠/兔通用型試劑盒k5007)均購自中山金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將以上病例參照相關(guān)文獻(xiàn)步驟［1］，進(jìn)行組織免疫組化染色，相同病例做平行標(biāo)本2例，并設(shè)置陰性對(duì)照。切片厚度4 μm備用。免疫組化采用Envision 2步法，以枸櫞酸鈉(pH 6.0)為修復(fù)液，高壓鍋抗原熱修復(fù)，高壓保持2 min;其余步驟按常規(guī)Envision法進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用PBS代替一抗設(shè)立空白對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 TK1為細(xì)胞質(zhì)著色，Ki-67為細(xì)胞核著色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPPS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組間計(jì)數(shù)資料的比較采用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、正常胃組織中Ki-67和TK1的表達(dá)兩者在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常胃組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。Ki-67陽性染色位于細(xì)胞核中，TK1陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)中。見表1，圖1、2。

2.2 Ki-67和TK1的表達(dá)與胃癌各臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Ki-67和TK1的表達(dá)與胃癌的病理分級(jí)無關(guān)(P＞0.05);Ki-67的表達(dá)與胃癌的腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)(P均＜0.05);TK1的表達(dá)與胃癌的腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期無關(guān)(P均 ＞0.05)。見表2。

2.3 胃癌組織中 TK1與 Ki-67表達(dá)的關(guān)系Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織中TK1與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.383，P=0.001)。見表3。

表1 Ki-67和TK1在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)

3 討論

胃癌在我國是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤首位。胃癌多見于男性，男女之比約為2∶1。平均死亡年齡為61.1歲。胃癌細(xì)胞的增殖、分裂失調(diào)是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，觀測細(xì)胞增殖強(qiáng)度和指數(shù)有助于評(píng)估腫瘤的性質(zhì)。TK1作為研究細(xì)胞增殖程度的新的標(biāo)志物，其與Ki-67的細(xì)胞增殖周期特征不同，主要在S期表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)，而Ki-67表達(dá)于除G0期外的各期。TK1是一種特殊激酶，催化胸苷轉(zhuǎn)變?yōu)橐涣姿嵝剀账?，是癌變?xì)胞DNA合成必須的前體物。在細(xì)胞增殖過程中，其催化脫氧核糖尿嘧啶核苷合成單磷酸脫氧核糖尿嘧啶核苷，然后在其他相關(guān)磷酸激酶的作用下，合成三磷酸脫氧核糖尿嘧啶核苷，參與DNA合成［2］。Morimoto等［3］對(duì)肝臟部分切除后大鼠血清TK1進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在大鼠手術(shù)恢復(fù)期，其肝臟TK1活性明顯增高，從而證實(shí)其在細(xì)胞增殖過程中的作用。TK的2種同工酶TK1、TK2分別定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。增殖周期中的TK1含量自細(xì)胞分裂G1期合成開始增加，在S期逐漸升高，至G2期達(dá)到最高［4］。胃癌的發(fā)生就是正常胃黏膜在各種損傷因子的作用下，導(dǎo)致黏膜活性大大增強(qiáng)。因此，通過檢測血清TK1和正常胃黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TK1含量和表達(dá)強(qiáng)度，就有可能為判斷胃癌黏膜內(nèi)上皮細(xì)胞從良性到惡性變化、從量變到質(zhì)變的過程和狀態(tài)提供了依據(jù)。

表2 Ki-67、TK1在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 Ki-67、TK1在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

TK1在血清學(xué)的檢測中應(yīng)用廣泛，且相關(guān)報(bào)道較多［5］，但其免疫組化方面的研究尚較少。本文應(yīng)用免疫組化方法檢測71例胃癌、20正常胃黏膜組織中的TK1及Ki-67的表達(dá)，進(jìn)而研究TK1在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及TK1與Ki-67兩者之間的相關(guān)性;同時(shí)研究TK1在評(píng)價(jià)患者預(yù)后中的作用。結(jié)果顯示，胃癌組織中TK1的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃組織，提示過表達(dá)的TK1可能與胃黏膜過度增殖和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān);對(duì)TK1的表達(dá)情況與胃癌的各臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TK1表達(dá)與胃癌的病理分級(jí)、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)，提示TK1的過量表達(dá)與胃癌發(fā)生有關(guān)，但對(duì)于判斷其進(jìn)展及預(yù)后意義不明顯，這有助于早期發(fā)現(xiàn)胃癌。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道TK1在大腸癌中的檢測結(jié)果一致［6］。

Ki-67是一種與細(xì)胞周期有關(guān)的蛋白質(zhì)，Ki-67是目前多種惡性腫瘤尤其是乳腺癌研究中的生物指標(biāo)，在其他腫瘤檢測中也常應(yīng)用［7］，可以通過Ki-67的檢測，了解惡性腫瘤的細(xì)胞增殖活性。Ki-67高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系，Ki-67的表達(dá)與胃癌的病理分級(jí)、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胃組織，達(dá)到或穿透漿膜層者高于侵犯黏膜層和肌層，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期者高于Ⅰ、Ⅱ期者，提示在胃癌組織中，病理分化越差，細(xì)胞惡性程度越高;病程越晚，增生越活躍，則Ki-67表達(dá)水平越高。Ki-67在某些良、惡性疾病間的表達(dá)有一些交叉，有些良性病變的 Ki-67指數(shù)甚至高于某些惡性病變［8］，因此單獨(dú)依靠 Ki-67來鑒別這些疾病時(shí)應(yīng)慎重。TK1和Ki-67在增殖指數(shù)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系方面表現(xiàn)出共同的特征，但相對(duì)于Ki-67而言，TK1在腺癌中是一種更可靠的增殖相關(guān)標(biāo)志物。因此可以通過聯(lián)合檢測TK1和Ki-67來觀測腫瘤的增殖程度、生物學(xué)性質(zhì)以及輔助病理學(xué)診斷。另外在方法學(xué)檢測的優(yōu)勢上，TK1表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)定位特征的免疫組化原位檢測要比其他檢測方法更精準(zhǔn)［9］。

［1］張毅敏，單綠虎，徐笑紅.細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶1在106例腫瘤病人的表達(dá)［J］.中國腫瘤，2008，17(3):247 －248.

［2］Zhang F，Li H，Pendleton AR，et al.Thymidine kinase 1 immunoassay:a potential marker for breast cancer T［J］.Cancer Detect Prev，2001，25(1):8 －15.

［3］Morimoto M，Numata K，Tanaka K.Rat peripheral mononuclear cell thymidine kinase activity increases during liver regenerative processes after partial hepatectomy［J］.J Gastroenterol Hepatol，1995，10(6):655－661.

［4］He Q，Skog S，Wang N，et al.Characterization of a peptide antibody against a C-terminal part of human and mouse cytosolic thymidine kinase，which is a marker for cell proliferation［J］.Eur J Cell Biol，1996，70(2):117 －124.

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［6］吳鴻雁，樊祥山，孟凡青，等.TK1、Ki-67在大腸癌發(fā)生發(fā)展中作用及其相關(guān)性［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25(3):282－286

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［9］Zhang F，Shao X，Li H，et al.A monoclonal antibody specific for human thymidine kinase 1［J］.Hybridoma，2001，20(1):25 －34.