李春雷，李志浩，劉 菁，李 鵬，鄭 芳，朱雪松

胃癌的發(fā)生發(fā)展與其生理位置有密切關系。首先，胃癌細胞的微環(huán)境(胞外低pH值、低氧濃度、高葡萄糖吸收等)，尤其是酸性微環(huán)境對胃癌細胞的侵襲和轉移、胃癌細胞對放化療的敏感性有著重要影響［1］。其次，人胃腸道正常組織分泌的生長激素釋放抑制素(Somatostatin，SST，生長抑素)的含量變化可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關［2］，而且SST在體內外實驗中顯示出抗腫瘤作用［3-4］。在腫瘤微酸環(huán)境的重要調節(jié)因子中，V型ATP酶發(fā)揮了重要作用，而質子泵抑制劑可顯著抑制V型ATP酶，發(fā)揮抗腫瘤作用［1］。同時，質子泵抑制劑還可通過降低V型ATP酶的活性而減弱腫瘤的酸化，從而逆轉腫瘤多藥耐藥的發(fā)生［5］。奧曲肽(Octreotide，OCT)是體外合成的生長抑素八肽類似物，具有比天然SST血漿半衰期長、作用更強大、耐受性好等優(yōu)點［6-7］，與胃部腫瘤相關生長抑素受體有很好的親和力。本文選擇不同抗腫瘤機制的非細胞毒藥物-奧曲肽和質子泵抑制劑-奧美拉唑共同作用于胃癌細胞，研究聯合用藥對胃癌細胞的影響，探討其抗腫瘤效應，以期為臨床胃癌化療中的聯合用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胃癌細胞株SGC-7901細胞，我院肝病分子實驗中心保存。

1.1.2 主要試劑 RPM11640培養(yǎng)基;胎牛血清(標準級)和0.25%胰蛋白酶(BOSTER公司);奧美拉唑(魯南制藥)，奧曲肽(諾華制藥)，碘化丙啶和MTT(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)。

1.1.3 主要設備 二氧化碳恒溫箱、超凈臺、倒置顯微鏡、酶標儀、96孔板，流式細胞分析儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株SGC-7901細胞置含有5%胎牛血清 RPM11640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)，1～2d換1次液，3d左右傳代，取對數生長期細胞試驗。

1.2.2 奧曲肽和奧美拉唑對人胃癌細胞SGC-7901生長的影響 選擇對數生長期胃癌SGC-7901細胞，常規(guī)消化后制成單細胞混懸液，計數調整細胞濃度為1×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔，37 ℃、5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，換為無血清的 RPMI164O液培養(yǎng)，孵育24 h后將細胞分為6組?？瞻捉M:無細胞，只有培養(yǎng)液;對照組:培養(yǎng)液不加藥物;奧曲肽組:不同濃度奧曲肽;奧美拉唑組:不同濃度奧美拉唑;聯合用藥組:不同濃度奧曲肽+奧美拉唑。其中奧曲肽和奧美拉唑設5個濃度段，每個濃度3個復孔。上述各組培養(yǎng)24 h后加入MTT繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入DMSO，振蕩溶解，于酶聯免疫檢測儀570 nm處測定各孔吸光度值(A)，計算抑制率。抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3 采用中效原理判斷奧曲肽與奧美拉唑聯合用藥的作用效果 抑制率(fa)=1-(實驗組平均A值/對照組平均A值)。根據中效方程式fa/fu=(D/Dm)m(fu為腫瘤細胞存活率，fu=1-fa;D為藥物濃度;Dm為中效濃度，即fa達到0.5效應時的藥物濃度)，方程兩邊取對數:log(fa/fu)=mlogD-mlogDm。設 y=log(fa/fu)，x=logD，a=-mlogDm(m為斜率，設m=b)，得直線方程:y=bx+a。計算出兩種藥物單用及合用時各自的中效濃度Dm(logDm=-a/b)，然后計算兩藥合用時在各種效應時的合用指數(CI)=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2，D1、D2為合用時產生 X 效應時兩藥各自所需的濃度，Dx1、Dx2為兩藥單用時產生X效應時各自的濃度(α=1表示兩種藥物為相互非排斥性藥物，α=0表示兩種藥物為相互排斥性藥物)。CI＜1為協同，CI=1為相加，CI＞1為拮抗。

1.2.4 奧曲肽和奧美拉唑對人胃癌SGC-7901細胞周期的影響 選擇對數生長期細胞，常規(guī)胰酶消化計數后，以RPMI1640培養(yǎng)基調整細胞懸液濃度為107/L，接種6孔培養(yǎng)板中，每孔 2 mL，于37℃、5%CO2的恒溫箱內培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，分組給藥。選擇上述MTT實驗中的中效濃度作為實驗終濃度，單獨和聯合作用于SGC-7901細胞，培養(yǎng)48 h后常規(guī)收集各組細胞，離心，去上清，加70%的預冷乙醇(4℃)，于4℃冰箱固定過夜，PBS洗滌2次，再離心去PBS后加入1 mL碘化吡啶，避光30 min，200目濾網過濾后，流式細胞儀檢測。

1.2.5 流式細胞儀檢測Bcl和Bax蛋白 選擇對數生長期胃癌SGC-7901細胞，常規(guī)消化后制成單細胞混懸液，調整細胞濃度后以2×107/L接種于小培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長旺盛貼壁后，去掉原培養(yǎng)液。分4組:對照組、奧曲肽組、奧美拉唑組、奧曲肽+奧美拉唑組，實驗重復3次，每次加入含藥血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化，計數，離心，PBS液洗滌2次。加入1∶100稀釋的一抗100 μL，37℃恒溫水浴溫育30 min，PBS液洗2次。加1∶20稀釋的 FITC標記的二抗100 μL，37 ℃溫育30 min，PBS 液洗2 次，離心，除去未結合的多余熒光抗體。加PBS液1.0 mL，用400目濾網過濾后上流式細胞儀檢測，測試前用雞紅細胞標準品調整儀器的變異系數值在5%以內。

1.3 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，方差齊性檢驗或正態(tài)檢驗后進行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 奧曲肽和奧美拉唑單用及合用對SGC-7901細胞生長的影響 隨著不同濃度的奧曲肽與奧美拉唑的濃度升高，藥物對SGC-7901細胞的增殖抑制作用逐漸增強，效應逐漸增加，聯合用藥的抑制率較相應單用藥組顯著增強，結果見表1。

表1 奧曲肽和奧美拉唑對SGC-7901細胞生長的影響(n=9)

2.2 奧曲肽與奧美拉唑聯合作用SGC-7901細胞的中效效應 按中效方程式計算得單用奧曲肽的中效濃度為6.92 mg/L，單用奧美拉唑時中效濃度為85.52 mg/L，當奧曲肽與奧美拉唑聯合應用時，奧曲肽、奧美拉唑的中效濃度分別為1.01、49.42 mg/L。同時，奧曲肽和奧美拉唑在低效應水平時CI＞1，而在多數效應范圍尤其是高水平效應時，CI指數均＜1，相互之間表現為協同作用，見圖1。

圖1 奧曲肽和奧美拉唑合用時CI與fa的關系圖

2.3 奧曲肽與奧美拉唑對SGC-7901細胞生長周期的影響 與對照組比較，1.0 mg/L奧曲肽能夠阻滯SGC-7901細胞的生長，使G0/G1期細胞增多(P＜0.05)，而50.0 mg/L奧美拉唑對細胞周期影響不大，但相同濃度的奧曲肽和奧美拉唑共同作用胃癌細胞SGC-7901后，G0/G1細胞比例顯著增大(P＜0.05)，而且超過單用藥組。

表2 奧曲肽與奧美拉唑單用及聯用對SGC-7901細胞周期的影響(%，n=3)

2.4 奧曲肽與奧美拉唑對SGC-7901細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 與對照組比較，各組胃癌SGC-7901細胞經過藥物處理后，各給藥組細胞Bcl-2蛋白表達均減少，Bax蛋白增加，見表3。

表3 奧曲肽和奧美拉唑對SGC-7901細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響(n=3)

3 討論

奧曲肽是具有廣泛生物學效應的生長抑素類似物，可治療消化道出血［8］、胰腺炎［9］、內分泌腫瘤以及胃、腸、胰等實體腫瘤，通過直接和間接作用發(fā)揮抗腫瘤作用［10］。研究表明，奧曲肽對人體內胃癌生長具有明顯抑制作用［11］。質子泵抑制劑抗腫瘤的效應機制可能是顯著降低了腫瘤細胞的異常高pH梯度，即胞外酸性pH和胞質堿性pH，阻止V-ATPases反應，進而允許抗瘤藥物進入細胞而發(fā)揮功能。早期研究［12］顯示，PPI在體內外抑制胃癌細胞凋亡。蔣鵬程等［13］報道，奧美拉唑可以誘導胃癌前病變組織細胞凋亡。張正等［14］報道，奧美拉唑能夠直接抑制胃癌細胞HGC-803的增殖。奧美拉唑作用胃癌細胞SGC-7901的相關報道較少。本研究中，奧美拉唑以濃度依賴方式明顯抑制胃癌細胞SGC-7901生長。奧曲肽與奧美拉唑聯合應用后，隨著濃度的增加，抗腫瘤作用也隨之增強，中效原理分析，兩者在大多數效應尤其是高效應范圍合用時，均產生協同效應(CI＜1)，聯合用藥的中效濃度明顯低于單用藥時各自的中效濃度，表明奧曲肽和奧美拉唑聯合作用比單獨作用效果好，能夠增強對胃癌細胞SGC-7901生長抑制作用。通過對流式細胞周期分析，與對照組比較，聯合用藥和單用奧曲肽作用胃癌SGC-7901細胞48 h后，G0/G1期細胞比例增多(P＜0.05)，奧美拉唑對細胞周期影響不大，并且聯合用藥組與單用藥組G0/G1期細胞比例的差異有統計學意義(P＜0.05)，提示奧美拉唑可能增強奧曲肽對胃癌細胞周期的阻滯作用，也間接證明奧美拉唑和奧曲肽共同作用胃癌細胞具有協同效應。同樣，聯合用藥能夠顯著下調Bcl-2、上調Bax蛋白表達，聯合用藥的效果優(yōu)于單用藥組(P＜0.05)，有協同誘導細胞凋亡作用，這種協同作用的機制尚不明確，可能是奧美拉唑改變了胃癌細胞的酸性環(huán)境而增強了奧曲肽的作用，值得深入研究。

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