文程，王薇，余麗蕓，侯喜林，單春橋，譚軍，孫景秀

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319；2.大慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校；3.大慶油田總醫(yī)院；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

輪狀病毒（Rotaviruses，RV）是引起人類(lèi)和動(dòng)物急性胃腸道傳染病的主要病原體。它主要感染小腸上皮細(xì)胞，從而造成細(xì)胞損傷，引起腹瀉，嚴(yán)重可導(dǎo)致脫水，進(jìn)而引起水和電解質(zhì)失衡而危及生命。輪狀病毒性腹瀉是世界上導(dǎo)致嬰幼兒急診和死亡的第二大疾病[1]，我國(guó)嬰幼兒腹瀉中32%～63%是因感染輪狀病毒所致[1]。此外，輪狀病毒對(duì)幼齡動(dòng)物也能夠產(chǎn)生巨大的危害。由于當(dāng)今對(duì)輪狀病毒腹瀉尚無(wú)治療的特效藥物，因此建立方便、快速、靈敏的檢測(cè)方法，隨時(shí)監(jiān)控輪狀病毒感染的情況，對(duì)控制其感染大規(guī)模流行的發(fā)生尤為重要。

ELISA技術(shù)因其具有操作簡(jiǎn)便、快速，敏感度高、特異性強(qiáng)，適合大規(guī)模樣本檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測(cè)。研究試圖以人源輪狀病毒（HRV）的全病毒作為包被抗原，建立檢測(cè)HRV的間接ELISA方法，并利用所建立的方法，對(duì)大慶市區(qū)內(nèi)兒童腹瀉患者中的HRV陽(yáng)性感染率進(jìn)行檢測(cè)，以初步分析HRV在大慶市區(qū)內(nèi)的流行病學(xué)特征，進(jìn)而為大慶市兒童輪狀病毒性腹瀉疾病的預(yù)防、診斷及治療提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株與血清

HRV參考毒株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；HRV參考陽(yáng)性血清是采集于臨床上確診的輪狀病毒腹瀉患者的血液樣本分離制備而成，并經(jīng)病毒中和試驗(yàn)證實(shí)為抗HRV陽(yáng)性；HRV參考陰性血清是采集于非腹瀉患者的血液樣本分離制備而成，并經(jīng)病毒中和試驗(yàn)證實(shí)為抗HRV陰性；1 452例待檢血清采自大慶市區(qū)主要的二級(jí)以上醫(yī)院的兒科門(mén)診及病房的腹瀉患兒。

1.2 主要試劑

胎牛血清購(gòu)自法國(guó)PAA Laboratories；HSA、TMB為AMRESCO公司分裝；脫脂奶粉購(gòu)自寶泰克生物科技公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體購(gòu)自Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 病毒的純化

應(yīng)用差速離心法對(duì)分離的病毒進(jìn)行純化[2]，對(duì)純化后的病毒經(jīng)基因定量?jī)x測(cè)定其濃度。然后，分裝保存于-70℃，備用。

1.4 間接ELISA方法的建立

1.4.1 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

按照設(shè)定的間接ELISA操作程序進(jìn)行試驗(yàn)，確定間接ELISA各種最佳反應(yīng)條件。

采用方陣滴定法和正交試驗(yàn)，分別對(duì)抗原的最佳包被緩沖液、抗原最佳包被濃度、血清最佳稀釋度及酶標(biāo)二抗最佳稀釋度進(jìn)行確定。用確定的最佳包被緩沖液以最佳包被濃度對(duì)濃縮純化后HRV稀釋后，4℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板，按間接ELISA操作程序，進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定OD450nm值，求出P/N值，以P/N值逐一確定最佳封閉液（5%脫脂乳-PBST、1%明膠-PBST、3%明膠-PBST）、最佳封閉時(shí)間（37℃封閉0.5、1、1.5、2、2.5 h）、血清與抗原最佳作用時(shí)間（37℃作用0.5、1、1.5、2 h，）、酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間 （37℃0.5 h、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h），最佳底物顯色液及終止液及底物最佳顯色時(shí)間，最終確立HRV間接ELISA檢測(cè)方法的操作程序，并按此程序進(jìn)行下面的試驗(yàn)。

1.4.2 間接ELISA檢測(cè)方法的評(píng)測(cè)

1.4.2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

通過(guò)板內(nèi)、板間重復(fù)性試驗(yàn)，評(píng)測(cè)可重復(fù)性。

1.4.2.2 符合性試驗(yàn)

通過(guò)試驗(yàn)建立的間接ELISA方法與臨床上應(yīng)用的輪狀病毒診斷試劑盒分別檢測(cè)來(lái)自同一本體的50份血清及糞便樣品，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，以系統(tǒng)評(píng)測(cè)敏感度、特異性及符合性（陰性符合率為敏感性，陽(yáng)性符合率為特異性，總符合率為符合性）。

1.5 大慶市區(qū)兒童腹瀉患者HRV感染率的調(diào)查

于2011年7月—2012年3月期間，從大慶市區(qū)內(nèi)的各二級(jí)以上醫(yī)院的兒科門(mén)診及病房，共采集1 452例腹瀉患兒的血液樣本；將采集的血樣分離制備成血清后，用建立的HRV間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。并對(duì)檢測(cè)結(jié)果按季節(jié)、腹瀉患兒的年齡、地區(qū)、性別等方面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)而得出大慶市兒童輪狀病毒感染率在季節(jié)、地域、年齡、性別等方面上的差異。

2 結(jié)果

2.1 病毒的純化結(jié)果

將鑒定好的HRV經(jīng)差速離心濃縮純化后，通過(guò)基因定量?jī)x測(cè)定，得出該HRV抗原含量為2.89mg·mL-1。

2.2 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

采用方陣滴定法和正交試驗(yàn)，確定HRV最佳包被液為50 mM pH 9.6碳酸鹽（CBS）緩沖液，抗原最佳包被濃度為10.0μg·mL-1，陰、陽(yáng)性血清的最適稀釋度為1∶200，酶標(biāo)二抗的最適稀釋度為1∶10 000。用確定的最佳包被緩沖液以最佳包被濃度對(duì)HRV稀釋后，4℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板，按間接ELISA操作程序進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化并確定了最佳封閉液及使用濃度為3%的明膠，封閉時(shí)間為37℃1 h；血清與抗原最佳作用時(shí)間為37℃30min；酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間為37℃1 h；最佳底物顯色液及終止液分別為T(mén)MB和1%SDS，底物最佳顯色時(shí)間37℃10min。

2.3 間接ELISA方法評(píng)測(cè)的結(jié)果

通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)得出，板內(nèi)、板間變異系數(shù)分別為2.27%～6.81%和3.71%～8.83%，根據(jù)Jacobson的報(bào)道[3]，表明間接ELISA方法在板內(nèi)、板間的變異程度很小，說(shuō)明具有較好的重復(fù)性。

通過(guò)符合性試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），試驗(yàn)建立的間接ELISA方法與RV診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率為91.3%，陰性符合率為93.1%，總符合率分別為92%，說(shuō)明試驗(yàn)建立的間接ELISA方法檢測(cè)的結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)。

表1 間接ELISA方法與RV試劑盒的檢測(cè)結(jié)果Table1 Results of comparison testbetween indirect ELISA and RVkit

2.4 大慶市區(qū)兒童腹瀉患者HRV感染率的調(diào)查結(jié)果

2.4.1 大慶市區(qū)內(nèi)兒童腹瀉患者的HRV感染的總體情況

對(duì)1452例腹瀉患兒的血液樣本進(jìn)行HRV感染率檢測(cè)的結(jié)果表明（圖1），大慶市五個(gè)行政區(qū)（薩爾圖區(qū)、讓胡路區(qū)、龍鳳區(qū)、大同區(qū)、紅崗區(qū)）的HRV陽(yáng)性感染率在38.6%～42.3%之間，平均為39.9%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=1.05，P值＞0.05，說(shuō)明大慶市區(qū)內(nèi)各區(qū)域間兒童腹瀉患者的HRV感染率無(wú)顯著差異。

圖1 感染陽(yáng)性率Fig.1 HRV infection rateswith the children diarrhea in Daqing

2.4.2 不同季節(jié)，大慶市區(qū)內(nèi)腹瀉患兒中HRV的感染情況

對(duì)檢測(cè)的結(jié)果按季節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明（圖2），夏、秋、冬、春（早春）四季中的腹瀉患兒的HRV感染率在22.7%～50.7%之間，其中以秋、冬兩季較高，夏季最低。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=72.31，P值=0.000，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HRV感染率在季節(jié)間差異極為顯著。其中，秋、冬兩季經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=1.22，P值＞0.05，無(wú)顯著性差異；夏、秋兩季經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=53.19，P值＜0.05，差異非常顯著；秋、早春兩季經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=5.15，P值＜0.05，有顯著性差異。

圖2 不同季節(jié)腹瀉患兒HRV感染陽(yáng)性率Fig.2 HRV infection rateswith the children diarrhea in different season

2.4.3 不同年齡段，兒童HRV感染的情況

依照兒童四個(gè)生長(zhǎng)階段，即嬰兒期（28 d～1周歲）、幼兒期（1～3周歲）、學(xué)齡前期（3～6周歲）及學(xué)齡期（6～12周歲），對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明（圖3），1～3周歲腹瀉患兒中HRV感染率最高為56.0%，28 d～1周歲腹瀉患兒次之，6周歲以后的腹瀉患兒中HRV感染率最低，僅為14.6%。對(duì)這幾組數(shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=149.90，P值=0.000，說(shuō)明不同年齡段的兒童HRV感染率差異非常顯著。其中，嬰、幼兒期經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=2.03，P值＞0.05，無(wú)顯著性差異；學(xué)齡前期、學(xué)齡期經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=22.21，P值＜0.05，有顯著性差異；嬰兒期與學(xué)齡前期經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=30.07，P值＜0.05，有顯著性差異。

圖3 不同年齡段腹瀉患兒HRV感染的陽(yáng)性率Fig.2 HRV infection rateswith the children diarrhea of differentage

2.4.4 不同區(qū)域，兒童HRV的感染情況

為深入研究大慶市五個(gè)主要城區(qū)各年齡段腹瀉患兒的HRV感染情況，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果按區(qū)域及年齡段進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，各地區(qū)28 d～1周歲腹瀉患兒中的HRV感染率差別不大，對(duì)結(jié)果經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=0.96，P值＞0.05，表明無(wú)顯著性差異；各地區(qū)1～3周歲腹瀉患兒的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2=6.47，P值＜0.05，有顯著性差異；各地區(qū)3～6周歲及6～12周歲腹瀉患兒的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)卡方檢驗(yàn)，x2值分別為0.36和0.31，P值均＞0.05，表明均無(wú)顯著性差異。上述結(jié)果說(shuō)明，在HRV易感的幼兒期階段（1～3周歲），大慶市各地區(qū)腹瀉患兒的HRV感染率體現(xiàn)出了明顯的差異，說(shuō)明HRV的感染可能與生活環(huán)境、衛(wèi)生條件、密切接觸、機(jī)體免疫等因素相關(guān)。

2.4.5 兒童腹瀉患者HRV感染率的性別差異調(diào)查

按腹瀉患兒的性別，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，各季節(jié)男、女性腹瀉患兒的HRV感染情況均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明輪狀病毒感染與性別無(wú)關(guān)。

3 討論

ELISA方法是由多個(gè)系統(tǒng)組成的，每個(gè)系統(tǒng)中的某一成分的相關(guān)參數(shù)的變化會(huì)對(duì)整個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生很大影響，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)，尤其是被包被病毒的純度與ELISA試驗(yàn)的特異性和敏感性密切相關(guān)，如果毒性較弱或不純，將會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性或假陰性的出現(xiàn)[4]。因此，試驗(yàn)首先利用差速離心技術(shù)對(duì)HRV進(jìn)行濃縮純化，以純化后的HRV作為包被抗原，通過(guò)試驗(yàn)摸索了檢測(cè)HRV間接ELISA方法的各項(xiàng)最佳條件，建立了間接ELISA操作程序，并通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)、符合性試驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)測(cè)。結(jié)果表明，具有較好的重復(fù)性，用于快速檢測(cè)HRV具有較高的敏感性，且特異性較強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確、真實(shí)、可靠。

利用試驗(yàn)建立的HRV間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)2011年7月—2012年3月期間，大慶市區(qū)內(nèi)的1 452例小兒腹瀉患者進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明大慶市近期兒童的HRV感染率平均為39.9%，在全國(guó)范圍內(nèi)的HRV感染率處于偏低的水平。在對(duì)大慶市五個(gè)主要城區(qū)兒童腹瀉患者輪狀病毒總體感染情況調(diào)查的基礎(chǔ)上，對(duì)不同季節(jié)腹瀉患兒輪狀病毒的感染率進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，輪狀病毒性腹瀉秋冬季的發(fā)病率明顯高于夏春季，這與處于世界溫帶地區(qū)的其他國(guó)家的兒童輪狀病毒感染情況相一致[5]，說(shuō)明輪狀病毒感染以寒冷的秋冬季為高峰期。對(duì)不同年齡段的腹瀉患兒HRV感染率的調(diào)查結(jié)果表明，1～3周歲的感染率（56%）略高于28 d～1周歲（51.1%），但明顯高于3～6周歲（31.1%）和6～12周歲（14.6%），說(shuō)明輪狀病毒性腹瀉在幼兒期的發(fā)病率較高，與其他研究結(jié)論一致；原因可能是由于處于該年齡段的兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，免疫力低，易受輪狀病毒感染所致；6個(gè)月以下的嬰兒由于從母體處獲得了一定的抗體，因此對(duì)輪狀病毒感染有一定的抵抗作用；3周歲以后的兒童，免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟，對(duì)HRV感染具備一定的抵抗力，因此即便是輕微感染HRV，也不致引起腹瀉的發(fā)生。對(duì)大慶市各城區(qū)同一年齡段腹瀉患兒HRV感染率的調(diào)查結(jié)果表明，各城區(qū)28 d～1周歲腹瀉患兒的HRV感染率無(wú)明顯差異，但在1～3周歲腹瀉患兒中差異較為顯著，位于市郊城區(qū)的該年齡段腹瀉患兒的HRV感染率（如大同區(qū)72.5%、紅崗區(qū)73.8%）明顯高于主城區(qū)（如薩爾圖區(qū)56.4%、讓胡路區(qū)59.8%），且郊區(qū)的HRV腹瀉患兒多數(shù)伴有其他感染癥狀，這可能與地區(qū)的衛(wèi)生條件、經(jīng)濟(jì)狀況、治療不及時(shí)等因素有關(guān)。有關(guān)理論也證實(shí)，發(fā)展中國(guó)家的輪狀病毒腹瀉的發(fā)病率與死亡率要遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家[6]。對(duì)大慶市腹瀉患兒的HRV感染率按性別進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果表明，男孩和女孩腹瀉患者的HRV感染情況無(wú)顯著性差異，說(shuō)明輪狀病毒感染與性別無(wú)關(guān)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)調(diào)查，大體可以得出輪狀病毒的感染與季節(jié)、年齡、衛(wèi)生條件、經(jīng)濟(jì)狀況及機(jī)體免疫力等因素有一定關(guān)系。所以，通過(guò)增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)、注意個(gè)人衛(wèi)生，保持環(huán)境衛(wèi)生的清潔，并對(duì)嬰兒提倡母乳喂養(yǎng)，對(duì)輪狀病毒腹瀉性疾病的預(yù)防應(yīng)該能起到一定的作用；但僅通過(guò)改善食物、水源及環(huán)境衛(wèi)生條件是不是能從根本上起到預(yù)防和控制HRV感染的作用，有待進(jìn)一步證實(shí)。

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