王鶴 ，梁宏儒 ，胡旭 ，趙達(dá) ，姜東君 ，尹輝 ，高佳濱 ，陳為宏 ，崔玉東 ，朱戰(zhàn)波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

佐劑在增強(qiáng)抗原免疫原性方面起到了重要作用。天然免疫系統(tǒng)的最新研究成果表明Toll-like receptor（TLR）的配體可以作為佐劑[1-3]。細(xì)菌的鞭毛賦予了細(xì)菌的運(yùn)動性，以及對宿主黏膜組織的粘附性，而鞭毛蛋白作為細(xì)菌鞭毛的主要組成蛋白是TLR5 配體[4]，可通過與TLR5 的結(jié)合，引起前炎癥反應(yīng)[5]。很多的研究都證實了鞭毛蛋白可以用于新型疫苗的研發(fā)，像在鼠疫耶爾森菌[6]、西尼羅病毒[7]、惡性瘧原蟲[8]、破傷風(fēng)內(nèi)毒素[9]以及禽流感[10-11]新型疫苗中，鞭毛蛋白都起到了有效的佐劑作用。

實驗擬通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白，并對其免疫原性進(jìn)行鑒定，為后期研究其在奶牛乳房炎新型疫苗中的佐劑作用奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）8014株（購于農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心）；大腸桿菌DH5α、XL1-Blue、原核表達(dá)載體pQE-30 質(zhì)粒均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.2 主要試劑

Tryptone、Yerst Extract、Agarose 為 OXOID 公司產(chǎn)品；dNTPs、Taq DNA Ploymerase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SphⅠ及T4 DNA Ligase、蛋白質(zhì)Marker 均為 Fermentas（MBI）公司產(chǎn)品；DNA Marker、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；脫脂奶粉、PEG8000、TEMED、Tween-20 均為Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌全菌體多抗血清由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室自制。

1.3 引物設(shè)計及合成

根 據(jù)GenBank 上S.typhimurium 基因序列（GenBank Accession No.1070204），設(shè)計一對PCR 引物F1 和R1，上游引物位于基因的1～21 位，下游引物位于1 466～1 485 位反向互補(bǔ)。并在上、下游引物5′末端分別引入BamHⅠ和SphⅠ限制性酶切位點(diǎn)，兩端加保護(hù)性堿基。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 485 bp，引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。

1.4 PCR 擴(kuò)增目的基因

以鼠傷寒沙門氏菌8014 株基因組DNA 為模板擴(kuò)增fliC 基因片段，反應(yīng)條件為94℃5 min；94℃40 s，59℃ 30 s，72 ℃ 1 min 循環(huán) 30 次；72℃延伸10 min。產(chǎn)物用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒按說明書操作回收目的基因。

1.5 fliC 基因的克隆及測序

回收的PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體，于16℃連接過夜。取連接產(chǎn)物10 μL 轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α菌株（TSS 法制備），涂布于含氨芐青霉素 100 μg ·mL-1的LB 瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)過夜。挑取數(shù)個轉(zhuǎn)化菌單菌落，于含100 μg ·mL-1 氨芐青霉素的2 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以BamHⅠ、SphⅠ雙酶切及PCR 擴(kuò)增鑒定質(zhì)粒。鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后純化回收目的片段，并與雙酶切后的表達(dá)載體pQE30（+）連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-Blue，用氨芐青霉素抗性進(jìn)行篩選，并經(jīng)PCR 和BamHⅠ、SphⅠ雙酶切鑒定，選PCR 和雙酶切結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒送生工測序。

1.6 fliC 基因的原核表達(dá)及可溶性鑒定

將XL1-Blue（FliC-pQE30）接種于含氨芐青霉素（200 μg ·mL-1）的 LB 液體培養(yǎng)基，取培養(yǎng)后的新鮮菌液，1%接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600 為0.4～0.5，加入終濃度為1.0 mmoL ·L-1IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后菌體經(jīng)裂解后離心，取沉淀和上清。將誘導(dǎo)產(chǎn)物、誘導(dǎo)產(chǎn)物裂解沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE，采集圖像，經(jīng)Bandscan 軟件分析重組蛋白FliC 的表達(dá)量。以空載體轉(zhuǎn)化菌XL1-Blue（pQE30）的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為對照。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的提取及純化

將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌XL1-Blue（FliC-pQE30）培養(yǎng)物離心后收集沉淀。無菌PBS 洗滌3 次，用鹽酸胍溶解液重懸，在冰浴條件下超聲裂解，于4℃以10 000 r ·min-1 離心15 min，收集上清，采用鎳柱親和層析試劑盒進(jìn)行純化。純化后的蛋白于4℃透析24 h，期間不斷地更換PBS 透析液，透析后的蛋白，用PEG8000 進(jìn)行濃縮。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析

將誘導(dǎo)表達(dá)的XL1-Blue（FliC-pQE30）經(jīng)SDSPAGE 電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，用含10%脫脂奶粉的PBST 4℃作用12 h；PBST 洗滌3 次后，以實驗室自制的小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌全菌體多抗血清作為一抗（1∶200 稀釋）作用1 h，充分洗滌后以HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 作為二抗（1∶400 稀釋）作用1 h，PBST 洗滌3 次后，DAB 顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果，拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 fliC 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果及TA 克隆結(jié)果

（1）1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，F(xiàn)liC 基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可見1 485 bp 的特異性條帶，大小均與預(yù)期相符，如圖1 所示。

圖1 FliC 的PCR 產(chǎn)物的電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product of fliC

（2）將純化的FliC 基因片段克隆到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化后選取疑似陽性質(zhì)粒為模板，對重組克隆FliC-pMD18-T 進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果在1 485 bp 處擴(kuò)增出一條與目的片段大小相符的基因片段；將PCR 鑒定為陽性的fliC-pMD18-T 質(zhì)粒用BamHⅠ和SphⅠ雙酶切鑒定，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)兩條兩個目的基因片段，大小分別為2 662 bp 和1 485 bp，與預(yù)期的結(jié)果相符。結(jié)果如圖2 所示：

圖2 FliC-pMD18-T 克隆載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR 鑒定Fig.2 Identification of FliC-pMD18-T plasmid by nucleate endonuclease digestion and by PCR

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒FliC-pQE30 經(jīng)BamHⅠ和SphⅠ雙酶切可見約3 458 bp載體片段和1 458 bp 的目的基因片段，經(jīng)PCR 擴(kuò)增可見1 485 bp 的特異性條帶，見圖3。測序結(jié)果顯示，與預(yù)期的基因序列完全一致。

圖3 FliC-pQE30 表達(dá)載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR 鑒定Fig.3 Identification of FliC-pQE30 plasmid by nucleate endonuclease digestion and by PCR

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

2.3.1 SDS-PAGE 分析：檢測結(jié)果顯示，XL1-Blue（FliC-pQE30）的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物可見相對分子質(zhì)量約56 kDa 的目的蛋白條帶，經(jīng)Bandscan 軟件分析，重組蛋白的表達(dá)量為菌體總蛋白的27%。重組融合蛋白以可融合和包涵體兩種形式表達(dá)，但主要以包涵體形式存在。經(jīng)鎳柱親和層析純化后，獲得單一條帶的目的蛋白。

2.3.2 Western blot 分析：結(jié)果顯示，將已純化的FliC蛋白，以一定比例稀釋的小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌全菌體多抗血清（1∶200 稀釋）為一抗，HRP 標(biāo)羊抗鼠IgG（1∶400 稀釋）為二抗，對重組蛋白進(jìn)行免疫原性分析，如圖5 所示，F(xiàn)liC 蛋白能與小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌全菌體多抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約為56 kDa 處可見明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致。

3 討論

長期以來，細(xì)菌的鞭毛僅被認(rèn)為是細(xì)菌的運(yùn)動器官，最近研究表明，鞭毛蛋白作為細(xì)菌鞭毛的主要成分，是一種很強(qiáng)的致炎因子[12]。鞭毛蛋白是沙門氏菌的主要抗原成分之一，該分子上既存在該菌血清分型的H 抗原，又具有屬特異的共同抗原[13]。

圖4 重組FliC 蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE results of recombinant FliC protein and purified protein

圖5 重組蛋白FliC 的全菌血清Western Blotting 結(jié)果Fig.5 Western blotting results of the recombinant FliC protein

研究以pQE30 為表達(dá)載體在大腸桿菌XL1-Blue 中表達(dá)克隆基因FliC。在試驗中，構(gòu)建的重組原核表達(dá)質(zhì)粒FliC-pQE30 在大腸桿菌XL1-Blue 中表達(dá)鞭毛重組基因，成功獲得鞭毛融合蛋白。pQE30 表達(dá)載體采用N 端6 個組氨酸（his）標(biāo)簽。高效表達(dá)產(chǎn)物的N 端具備6 個his，便于采用鎳柱親和層析純化目標(biāo)蛋白。以融合表達(dá)形式獲得目的蛋白的方法被越來越多的科研人員所采用[14]，研究所選擇的pQE30表達(dá)體系正是屬于融合表達(dá)系統(tǒng)，這為我們大量獲取鞭毛蛋白提供了良好的保障。帶異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)啟動子的質(zhì)粒表達(dá)外源蛋白的總量可以達(dá)到全菌蛋白的30%以上。為了獲得外源基因在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)，需增加表達(dá)質(zhì)粒的拷貝數(shù)量、提高外源基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平及防止表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽降解，為此我們用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)FliC 融合蛋白，其優(yōu)越性在于：通過誘導(dǎo)表達(dá)，使細(xì)菌的生長與外源基因的表達(dá)分開，合理地調(diào)節(jié)好宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系，從而提高Flic 的表達(dá)水平。為了盡可能多的表達(dá)我們所需的目的蛋白，我們誘導(dǎo)表達(dá)時間進(jìn)行了選擇優(yōu)化，最終確定的最佳表達(dá)條件是加入的IPTG 濃度為1 mM、37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。張晶等人[15]通過構(gòu)建了gapC-pQE30 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 M15（pREP4），IPTG 誘導(dǎo)后，表達(dá)出GapC 蛋白，與研究結(jié)果相一致。通過這些優(yōu)化措施獲得了FliC 蛋白的高效表達(dá)，經(jīng)超聲破碎，離心獲得的上清過鎳柱做親和純化，收集目的蛋白，PBS 透析，PEG8000 濃縮后，最后經(jīng)SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)所得目的蛋白的純化程度理想。Western Blotting 試驗中純化的重組蛋白FliC 可以與小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌全菌體血清相結(jié)合，出現(xiàn)單一的目的條帶，結(jié)果表明構(gòu)建的該重組蛋白具有天然蛋白的活性。

試驗通過克隆鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC 全基因并測序列鑒定，構(gòu)建了fliC-pQE30 原核表達(dá)載體，并讓其在大腸桿菌XL1-Blue 中大量表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化后得到了理想的目的蛋白；從FliC 基因全序列中可以看到其與已經(jīng)報道的序列高度同源，同源性可達(dá)100%，Western Blotting 試驗中純化的重組蛋白FliC 可以與小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌全菌體血清相結(jié)合，出現(xiàn)單一的目的條帶，結(jié)果表明構(gòu)建的該重組蛋白具有天然蛋白的活性，可以用來進(jìn)行下一步的實驗研究。

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