齊海峰,陳維靜
(遼寧修正生物制藥有限公司,本溪117000)
大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.唐古特大黃Rheumtangguticum Maxim.Ex balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖,具有瀉熱通腸,涼血解毒,逐瘀通經(jīng)等功效。臨床上常用于實熱便秘,積滯腹痛,瀉痢不爽,濕熱黃疸,血熱吐衄等證的治療[1]。蒽醌類化合物是大黃的主要有效部位,包括大黃酸等5個游離蒽醌。研究發(fā)現(xiàn)大黃酸具有保肝[2-3]、抗纖維化、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用[4],有很重要的臨床藥用價值,為研究的熱點。
大黃的提取最常用的優(yōu)化方法是正交設(shè)計法[5]和均勻設(shè)計法[6],但是這兩種方法存在一定的不足。星點設(shè)計—效應(yīng)面法作為優(yōu)選工藝的方法之一,彌補了正交設(shè)計法和均勻設(shè)計法的缺限,在國內(nèi)廣泛運用[7-8]。星點設(shè)計采用線性或非線性擬合的實驗設(shè)計方法,可以減少試驗次數(shù),并且提高了試驗的精密度。響應(yīng)面分析法是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計方法,通過對響應(yīng)面等值線的分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。實驗以大黃酸的含量為指標,采用3因素5水平的星點設(shè)計表安排提取工藝實驗,結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選大黃的提取工藝,為其開發(fā)提供依據(jù)。
美國Waters高效液相色譜儀(2695溶劑管理系統(tǒng),2996二極管陣列檢測器,美國Waters柱溫箱,Empower2工作站);PTHW型電子恒溫電熱套(河南予華儀器有限公司);FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DZG6050SA真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);KQ-50B超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。
大黃酸對照品(0757-200206)(中國藥品生物制品檢定所),大黃藥材購于哈藥集團世一堂飲片廠,經(jīng)檢驗,符合《中國藥典》2010年版一部規(guī)定。水為娃哈哈純凈水。甲醇色譜純(天津四友試劑廠),其他試劑為分析純。
2.1.1 色譜條件色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm×150mm,5μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15);流速為1mL·min-1;檢測波長:254 nm;進樣量:10μL。
2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取大黃酸對照品適量,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解至刻度,制成濃度為0.175mg·mL-1的溶液。
2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約0.1 g,精密稱定,置50mL錐形瓶中,精密加甲醇25 mL,稱定重量,加熱回流30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液5 mL,置50mL圓底燒瓶中,揮去甲醇,殘渣加2.5 moL·L-1硫酸溶液20 mL,置水浴中加熱回流2 h,放冷,加氯仿20mL,回流30min,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,分取氯仿液,濾過,酸液再加氯仿提取3次,每次20mL,分別濾過氯仿液,最后用氯仿10mL分次洗滌濾器,合并氯仿液和洗液,加水30mL洗滌氯仿液,棄去水洗液,氯仿液蒸干,殘渣加甲醇5 mL使溶解,并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)過濾,取續(xù)濾液,即得。
根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)的實際,實驗采用乙醇回流提取法。實驗中提取次數(shù)和藥材粒徑為非連續(xù)變量,回歸處理困難,因此本試驗固定提取次數(shù)為2次,藥材粒徑以通過3號篩為準。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,選擇乙醇濃度(X1)、料液比(X2)和提取時間(X3)3個因素為自變量,每個因素確定5個水平,共20個試驗點(6個中心點),以大黃酸含量作因變量考察指標,采用星點設(shè)計提取工藝條件,運用響應(yīng)面分析法分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù),因素水平編碼見表1,試驗安排和結(jié)果見表2。
表1 提取工藝因素水平編碼Table1 Factors and levels of response surface methodology test
表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Results of response surface methodology test
續(xù)表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Continued Table2 Results of response surface methodology test
應(yīng)用Design-Expert7.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,得到乙醇濃度(X1)、料液比(X2)及提取時間(X3)與大黃酸含量之間的二次多項回歸方程,回歸方程為:
回歸方程系數(shù) r2=0.9459(r=0.9725),說明模型能解釋97.25%響應(yīng)值的變化,表明該回歸模型的擬合情況良好,回歸方程的代表性較好,能準確預(yù)測實際情況。其校正決定系數(shù)(adj-R2)為0.8973(r=0.9472),表明此模型能解釋94.87%效應(yīng)值變化,因此該模型擬合程度良好。
對上述回歸模型進行顯著性檢驗,結(jié)果見表3。表3回歸方程顯著性檢驗P<0.0001,回歸方程顯著性檢驗表明,一次項乙醇濃度(X1)和料液比(X2)對大黃酸含量的線性效應(yīng)極顯著(P<0.001);一次項提取時間(X3),二次項中對大黃酸含量的曲面效應(yīng)高度顯著(P<0.01);一次項提取時間(X3)和二次項中X12對大黃酸含量的線性效應(yīng)顯著(P<0.05);乙醇濃度(X1)和料液比(X2)交互項(X1X2)、乙醇濃度(X1)和提取時間(X3)交互項(X1X3)、料液比(X2)和提取時間(X3)交互項(X2X3)的 P 值均大于 0.05,說明各因素間的交互作用不顯著。
表3 回歸模型方差分析Table3 Varianceanaly sisresults of rhein
依據(jù)回歸方程,在保持1個因素編碼值為0時,借助Design-Expert 7.0軟件繪制其他2個因素與響應(yīng)值關(guān)系的三維響應(yīng)面圖,結(jié)果見圖1~圖3。由圖可以看出乙醇濃度(X1)和料液比(X2),乙醇濃度(X1)和提取時間(X3)及料液比(X2)和提取時間(X3)對大黃酸含量的提取影響較為顯著,且響應(yīng)曲面陡峭。
圖1 乙醇濃度和料液比對大黃酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot of the effects of ethanol fraction and solid-liquid ratio on the yield rate of rhein
圖2 乙醇濃度和提取時間對大黃酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plotof the effects of ethanol fraction and extraction time on the yield rate of rhein
為確定這三個影響因素的最佳取值,通過Design-Expert 7.0軟件分析,得出回歸模型存在最大值點,(X)的代碼值分別為1.08,1.28,0.77,與之對應(yīng)的實測值乙醇濃度(X1)為82.84%,料液比(X2)為1∶15.04,提取時間(X3)為2.73 h,此時大黃中大黃酸含量的最大估計值為2.04mg·g-1。
圖3 料液比和提取時間對大黃酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plotof the effects of solid-liquid ratio and extraction time on the yield rate of rhein
為了驗證此提取模型方程的適用性,在乙醇濃度、料液比、提取時間最優(yōu)的水平上,重復(fù)試驗3次,提取物總含量為2.02mg·g-1(RSD為0.21%),與預(yù)測值2.04 mg·g-1吻合極好,說明用此模型指導(dǎo)實踐具有非常好的效果。
由于星點設(shè)計—響應(yīng)面優(yōu)化法采用非線性模型擬合,在中心點進行重復(fù)性實驗的次數(shù)越多,越可以提高實驗的精確度,預(yù)測值越接近真實值,所以實驗采用6次重復(fù)試驗。實驗方法簡便合理、穩(wěn)定,可預(yù)測性較優(yōu)。
試驗采用響應(yīng)面分析法確定了星點設(shè)計優(yōu)化的大黃中大黃酸提取工藝的最優(yōu)條件:乙醇濃度(X1)為82.84%,料液比(X2)為1∶15.04,提取時間(X3)為2.73 h,在此條件下,大黃中大黃酸含量的最大估計值為2.04mg·g-1,試驗結(jié)果與模型預(yù)測值相符。
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