齊海峰，陳維靜

（遼寧修正生物制藥有限公司，本溪117000）

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.唐古特大黃Rheumtangguticum Maxim.Ex balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖，具有瀉熱通腸，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)等功效。臨床上常用于實熱便秘，積滯腹痛，瀉痢不爽，濕熱黃疸，血熱吐衄等證的治療[1]。蒽醌類化合物是大黃的主要有效部位，包括大黃酸等5個游離蒽醌。研究發(fā)現(xiàn)大黃酸具有保肝[2-3]、抗纖維化、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用[4]，有很重要的臨床藥用價值，為研究的熱點。

大黃的提取最常用的優(yōu)化方法是正交設(shè)計法[5]和均勻設(shè)計法[6]，但是這兩種方法存在一定的不足。星點設(shè)計—效應(yīng)面法作為優(yōu)選工藝的方法之一，彌補了正交設(shè)計法和均勻設(shè)計法的缺限，在國內(nèi)廣泛運用[7-8]。星點設(shè)計采用線性或非線性擬合的實驗設(shè)計方法，可以減少試驗次數(shù)，并且提高了試驗的精密度。響應(yīng)面分析法是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計方法，通過對響應(yīng)面等值線的分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。實驗以大黃酸的含量為指標，采用3因素5水平的星點設(shè)計表安排提取工藝實驗，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選大黃的提取工藝，為其開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Waters高效液相色譜儀（2695溶劑管理系統(tǒng)，2996二極管陣列檢測器，美國Waters柱溫箱，Empower2工作站）；PTHW型電子恒溫電熱套（河南予華儀器有限公司）；FA2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DZG6050SA真空干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；KQ-50B超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

大黃酸對照品（0757-200206）（中國藥品生物制品檢定所），大黃藥材購于哈藥集團世一堂飲片廠，經(jīng)檢驗，符合《中國藥典》2010年版一部規(guī)定。水為娃哈哈純凈水。甲醇色譜純（天津四友試劑廠），其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃酸含量測定方法[1]

2.1.1 色譜條件色譜柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×150mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速為1mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣量：10μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取大黃酸對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成濃度為0.175mg·mL-1的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.1 g，精密稱定，置50mL錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50mL圓底燒瓶中，揮去甲醇，殘渣加2.5 moL·L-1硫酸溶液20 mL，置水浴中加熱回流2 h，放冷，加氯仿20mL，回流30min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分取氯仿液，濾過，酸液再加氯仿提取3次，每次20mL，分別濾過氯仿液，最后用氯仿10mL分次洗滌濾器，合并氯仿液和洗液，加水30mL洗滌氯仿液，棄去水洗液，氯仿液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 星點試驗設(shè)計

根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)的實際，實驗采用乙醇回流提取法。實驗中提取次數(shù)和藥材粒徑為非連續(xù)變量，回歸處理困難，因此本試驗固定提取次數(shù)為2次，藥材粒徑以通過3號篩為準。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇乙醇濃度（X1）、料液比（X2）和提取時間（X3）3個因素為自變量，每個因素確定5個水平，共20個試驗點（6個中心點），以大黃酸含量作因變量考察指標，采用星點設(shè)計提取工藝條件，運用響應(yīng)面分析法分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，因素水平編碼見表1，試驗安排和結(jié)果見表2。

表1 提取工藝因素水平編碼Table1 Factors and levels of response surface methodology test

表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Results of response surface methodology test

續(xù)表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Continued Table2 Results of response surface methodology test

2.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Design-Expert7.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到乙醇濃度（X1）、料液比（X2）及提取時間（X3）與大黃酸含量之間的二次多項回歸方程，回歸方程為:

回歸方程系數(shù) r2=0.9459（r=0.9725），說明模型能解釋97.25%響應(yīng)值的變化，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準確預(yù)測實際情況。其校正決定系數(shù)（adj-R2）為0.8973（r=0.9472），表明此模型能解釋94.87%效應(yīng)值變化，因此該模型擬合程度良好。

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。表3回歸方程顯著性檢驗P＜0.0001，回歸方程顯著性檢驗表明，一次項乙醇濃度（X1）和料液比（X2）對大黃酸含量的線性效應(yīng)極顯著（P＜0.001）；一次項提取時間（X3），二次項中對大黃酸含量的曲面效應(yīng)高度顯著（P＜0.01）；一次項提取時間（X3）和二次項中X12對大黃酸含量的線性效應(yīng)顯著（P＜0.05）；乙醇濃度（X1）和料液比（X2）交互項（X1X2）、乙醇濃度（X1）和提取時間（X3）交互項（X1X3）、料液比（X2）和提取時間（X3）交互項（X2X3）的 P 值均大于 0.05，說明各因素間的交互作用不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table3 Varianceanaly sisresults of rhein

2.4 響應(yīng)面分析及最優(yōu)提取條件的確定

依據(jù)回歸方程，在保持1個因素編碼值為0時，借助Design-Expert 7.0軟件繪制其他2個因素與響應(yīng)值關(guān)系的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖1～圖3。由圖可以看出乙醇濃度（X1）和料液比（X2），乙醇濃度（X1）和提取時間（X3）及料液比（X2）和提取時間（X3）對大黃酸含量的提取影響較為顯著，且響應(yīng)曲面陡峭。

圖1 乙醇濃度和料液比對大黃酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot of the effects of ethanol fraction and solid-liquid ratio on the yield rate of rhein

圖2 乙醇濃度和提取時間對大黃酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plotof the effects of ethanol fraction and extraction time on the yield rate of rhein

為確定這三個影響因素的最佳取值，通過Design-Expert 7.0軟件分析，得出回歸模型存在最大值點，（X）的代碼值分別為1.08，1.28，0.77，與之對應(yīng)的實測值乙醇濃度（X1）為82.84%，料液比（X2）為1∶15.04，提取時間（X3）為2.73 h，此時大黃中大黃酸含量的最大估計值為2.04mg·g-1。

圖3 料液比和提取時間對大黃酸含量影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plotof the effects of solid-liquid ratio and extraction time on the yield rate of rhein

2.5 模型的驗證

為了驗證此提取模型方程的適用性，在乙醇濃度、料液比、提取時間最優(yōu)的水平上，重復(fù)試驗3次，提取物總含量為2.02mg·g-1（RSD為0.21%），與預(yù)測值2.04 mg·g-1吻合極好，說明用此模型指導(dǎo)實踐具有非常好的效果。

3 結(jié)論

由于星點設(shè)計—響應(yīng)面優(yōu)化法采用非線性模型擬合，在中心點進行重復(fù)性實驗的次數(shù)越多，越可以提高實驗的精確度，預(yù)測值越接近真實值，所以實驗采用6次重復(fù)試驗。實驗方法簡便合理、穩(wěn)定，可預(yù)測性較優(yōu)。

試驗采用響應(yīng)面分析法確定了星點設(shè)計優(yōu)化的大黃中大黃酸提取工藝的最優(yōu)條件：乙醇濃度（X1）為82.84%，料液比（X2）為1∶15.04，提取時間（X3）為2.73 h，在此條件下，大黃中大黃酸含量的最大估計值為2.04mg·g-1，試驗結(jié)果與模型預(yù)測值相符。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:22.

[2]郭美姿，徐海榮，李孝生.大黃酸對小鼠急性肝損傷的影響[J].中醫(yī)藥研究，2002，18（1）:37-38.

[3]郭美姿，李孝生，沈鼎明，等.大黃酸對大鼠肝纖維化形成的影響[J].中華肝臟病雜志，2003，11（1）:26-29.

[4]劉彥珠，羅國安.大黃素和大黃酸對平滑肌細胞增殖作用研究[J].生物物理學(xué)報，1998，14（2）:240-243.

[5]楊晶晶，張?zhí)K陽，韓泳平.正交法優(yōu)化大黃中大黃酸的提取工藝的研究[J].西南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2010，36（3）:418-420.

[6]廖國平，賀帥，張忠義.均勻設(shè)計法優(yōu)選大黃酸提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，39（22）:13415-13416.

[7]徐金龍，張紅梅，徐秀泉.響應(yīng)面分析法優(yōu)化牡丹皮中總黃酮的提取工藝[J].中國藥房，2011，22（27）:2536-2538.

[8]徐金龍，張紅梅，徐秀泉.響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化牡丹皮中總酚的提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）:19295-19297.