靳明武，張洋龍，孫曉雨，邵光喜，倪宏波

（1.黑龍江農墾總局九三管理局畜牧獸醫(yī)局，嫩江161441；2.黑龍江八一農墾大學動物科技學院）

近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,養(yǎng)殖數(shù)量不斷增多,動物疫病尤其是傳染病日趨復雜,病譜逐漸擴大，豬病多以病原的混合感染或繼發(fā)感染為主要的流行形式。豬群發(fā)病往往不是由單一病原所致,而是以兩種或兩種以上的病原體相互協(xié)同作用所造成的。這樣常常導致豬群的高發(fā)病率和高死亡率,危害極其嚴重,而且控制難度大[1]?；旌细腥景ú《镜幕旌细腥尽⒓毦幕旌细腥疽约安《九c細菌的混合重感染。在病毒的混合感染中,以豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬環(huán)狀病毒2型、豬瘟病毒、豬流感病毒以及偽狂犬病病毒之間的混合感染較為常見,特別是豬繁殖與呼吸綜合征病毒與環(huán)狀病毒2型的雙重感染最為嚴重,由此造成豬群的雙重免疫抑制,抵抗力下降[2-3]。細菌的混合感染主要涉及豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌,豬多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、附紅細胞體等。另外病原的繼發(fā)感染在規(guī)?；i場中也十分普遍,特別是在豬群存在原發(fā)感染（如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬環(huán)狀病毒2型、豬肺炎支原體）情況下,一旦應激因素和飼養(yǎng)管理不良,就很容易發(fā)生細菌性繼發(fā)感染[4-5]。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬群發(fā)生以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病。在發(fā)病過程中會出現(xiàn)短暫性的兩耳皮膚紫紺，故又稱為藍耳病。主要感染途徑為呼吸道，空氣傳播、接觸傳播、精液傳播和垂直傳播為主要的傳播方式，病豬、帶毒豬和患病母豬所產(chǎn)的仔豬以及被污染的環(huán)境、用具都是重要的傳染源。此病在仔豬中傳播比在成豬中傳播更容易。本病主要采取綜合防制措施及對癥療法[6]。

豬放線桿菌是一種條件性致病菌，常存在于健康豬的扁桃體和上呼吸道，因此，對本病的預防應加強豬群的飼養(yǎng)管理，飼喂高營養(yǎng)的全價料，搞好豬舍的衛(wèi)生消毒，防止皮膚、黏膜受損，局部損傷后及時處理與治療[7]。

最近兩年實驗室通過對臨床送檢病料進行實驗室診斷，結果顯示目前豬場的混合感染比較嚴重且很普遍，試驗是對山東某豬場送檢病料進行實驗室診斷，現(xiàn)將結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

山東地區(qū)某豬場送檢的一例病死仔豬，無菌采集其肺、淋巴結等組織。

1.1.2 試劑

Marker DL 2000購自大連寶生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄盒購自MBI公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的：豬支原體P46基因序列；豬巴氏桿菌16SrRNA基因序列；豬鏈球菌cps2J基因序列、副豬嗜血桿菌16SrRNA基因序列、胸膜肺炎放線桿菌omlA基因序列；豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒美洲型ATCC VR-2332參考毒株序列；豬瘟病毒Alfort株的基因序列；圓環(huán)病毒2型的全基因序列中的ORF1序列等基因序列設計特異引物。豬支原體F5′`CCAGGATGCACAAAATAACTG3′，`R5′`ACCCGAAGAACTTCAACAGC3′，目的片段大小為795 bp，`豬巴氏桿菌：F5′-AGGGCACGCAGGCGG ACTTTTA-3′，R5′-ATCGACAGCGTTTACAGCGTGG A-3′，目的片段大小為253 bp；豬鏈球菌：F5′-GATAGATGACGGTTCTTCAGATT-3′，R5′-TCCTCTC CTAACCACTGTTCAG-3′，目的片段大小為450 bp；副豬嗜血桿菌F5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，R5′-GGCTTCGTCACCCTCTCTGT-3′，目的片段大小為822 bp；胸膜肺炎放線桿菌F5′-AAGGTTGATA TGTCCGCACC-3′，R5′-CACCGATTACGCCTTGCCA-3′，目的片段大小為450 bp；藍耳F5′-GCAAGCAGC AAAAGAAAAAGAAGG-3′，R5′-GCGTCGGCAAACT AAACTCCACAG-3′，目的片段大小為309 bp；圓環(huán)病毒F5′-GAGTCTGGTGACCGTTGC-3′，R5′-TTCC TCCGTGGATTGTTC-3′，目的片段大小為493 bp；豬瘟病毒F5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′，R5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′，目的片段大小為507 bp；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離鑒定

1.2.1.1 細菌分離純化及培養(yǎng)特性觀察

分別無菌剪取一小塊深部組織臟器，分別接種涂抹于血瓊脂培養(yǎng)基上，分別做需氧和厭氧培養(yǎng)，置37℃恒溫箱中24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血情況等。挑取疑似菌的單個菌落進行純培養(yǎng)，劃線于血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h。然后將分離得到的細菌接種到不同的固體培養(yǎng)基上觀察其生長特性。

1.2.1.2 革蘭氏染色

利用革蘭氏染色技術在油鏡下觀察細菌的形態(tài)及顏色，紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。

1.2.1.3 生化實驗鑒定

純化 株接種常規(guī)糖類培養(yǎng)基，M．R、V-P、靛基質、脲酶、氧化酶、接觸酶、枸櫞酸鹽等生化實驗。

1.2.1.4 細菌DNA粗提取

挑取單個菌落懸浮于含100μL超純水的1.5 mL離心管中，震蕩混勻，煮沸10min后置于冰上冷卻2min，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液作為PCR反應的粗制DNA模板，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒鑒定

1.2.2.1 組織DNA提取：按照TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒（購自TIANGEN公司）上面的步驟說明進行操作。

1.2.2.2 組織RNA提取：按照RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒（購自QIAGEN公司）上面的步驟說明進行操作。

1.2.2.3 RNA反轉錄：按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄盒（購自MBI公司）上面的步驟說明進行操作。

1.2.3 PCR擴增

以實驗室分離得到的DNA和cDNA為模板，豬巴氏桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬瘟病毒、藍耳病毒、圓環(huán)病毒等的特異性引物為引物進行PCR反應擴增，擴增體系如下：PCR Master Mix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，加去離子水補至25μL。PCR反應程序：95℃預變性5min，94℃變性30 s，退火30 s（巴氏桿菌56.5℃，豬鏈球菌54℃，副豬嗜血桿菌60℃，胸膜肺炎放線桿菌60℃，豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒57℃，圓環(huán)病毒52℃，豬瘟病毒60℃），72℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72℃終延伸10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測

取5μL擴增產(chǎn)物加入點樣孔，以165 V電壓進行1%瓊脂糖凝膠（含1%溴化乙錠2μL）電泳。電泳液用1×TAE緩沖液。25 min后在紫外燈下觀察擴增結果，并一次成像拍照。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

臨床表現(xiàn)患病仔豬群表現(xiàn)呼吸困難、肌肉震顫、共濟失調、打噴嚏，有的仔豬耳部發(fā)紫和身體末端皮膚發(fā)紺。發(fā)病豬體溫升高，喘氣時有時伴有震顫或呈劃水樣。

2.2 病理學診斷

主要病理變化為彌漫性間質性肺炎，并伴有卡他性肺炎。腹膜、腎周圍脂肪、腸系膜淋巴結、皮下脂肪和肌肉等部位發(fā)生水腫，可見胸膜炎、心包炎。

2.3 實驗室診斷

2.3.1 培養(yǎng)特性

從病料中分離得到一種細菌，對其進行培養(yǎng)特性鑒定。分離菌在綿羊鮮血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板上生長良好，在普通瓊脂平板生長緩慢，在麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板上不生長，判定本菌嚴格需要V因子。綿羊鮮血瓊脂平板上10%CO237℃培養(yǎng)24 h形成細小、圓形、透明的黏稠菌落，直徑約1mm，可見β溶血環(huán)。

2.3.2 革蘭氏染色

用病料中所分離的細菌進行革蘭氏染色、涂片、鏡檢。可見其為兩極染色的桿菌。

2.3.3 生化試驗

純化菌株發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖及甘露糖。M.R、V-P和靛基質試驗均為陰性，不產(chǎn)生H2S。氧化酶、接觸酶、脲酶、枸檬酸鹽試驗陽性。

2.3.4 PCR

2.3.4.1 細菌PCR

對純培養(yǎng)的細菌做菌落PCR，分別選用放線桿菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、支原體和鏈球菌的特異性引物，對細菌進行PCR鑒定。對PCR結果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。結果發(fā)現(xiàn)，在加樣孔1的450 bp左右處看到一條清晰的特異條帶，與放線桿菌的引物目的片段大小相一致（如圖1）。

2.3.4.2 病毒PCR

以組織中提取的病毒DNA以及病毒RNA反轉錄的cDNA為模板，分別選用圓環(huán)病毒、藍耳病毒和豬瘟病毒的特異性引物，對病毒進行PCR鑒定。PCR結果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。結果發(fā)現(xiàn)，在加樣孔2的約300 bp處看到清晰條帶，與藍耳病毒的引物目的片段大小相一致（如圖2）。

圖1 細菌PCR結果Fig.1 The results of bacterial PCR

圖2 病毒PCR結果Fig.2 The results of Virus PCR

3 討論

通過對該豬場的病料進行細菌的分離與純化，發(fā)現(xiàn)該病豬至少感染了一種細菌，并對該菌進行培養(yǎng)特性觀察、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗以及PCR檢測，結果表明它的各種特性均與放線桿菌相符，且PCR產(chǎn)物大小也與其引物目的片段大小一致。因此確定該種菌為放線桿菌。本實驗還對該送檢病料進行了病毒的檢測，發(fā)現(xiàn)其感染有藍耳病毒。再結合其臨床癥狀、病理變化可以確診該病料為藍耳病毒和放線桿菌混合感染。

近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,養(yǎng)殖數(shù)量不斷增多,動物疫病尤其是傳染病日趨復雜,病譜逐漸擴大,形成多種疾病并存的混合感染。尤其是春季來臨之際，由于氣溫回升變暖，各種病菌將會大量繁殖，而同時經(jīng)歷冬季，豬的體質有所下降，抗病能力減弱，如果在飼養(yǎng)管理過程中不加注意，將會引起疫病的發(fā)生，造成不良后果，直接影響經(jīng)濟效益。因此，疾病的預防尤為重要[8-9]。

首先，應該加強飼養(yǎng)管理制度，保持豬舍溫暖、干燥、通風、清潔，經(jīng)常對豬圈消毒，消除病菌的生存環(huán)境。春季氣溫變化大，仔豬體溫調節(jié)功能還不成熟，抗寒、抗病能力差。因此要保持豬舍溫暖、干燥、通風，以適宜豬的生長。根據(jù)春季豬的生長需求，要對使用的豬舍進行必要的維修，做到防雨、防風、防潮。創(chuàng)造良好的環(huán)境條件是保證仔豬健康快速成長的基礎。要保持豬舍環(huán)境衛(wèi)生，定期對豬舍進行徹底消毒[10]。

其次，春季病菌活躍，疫病易發(fā)。因此要嚴格按照免疫程序要求，按時、按質做好豬的免疫注射工作。一旦發(fā)現(xiàn)疫情，要嚴格按規(guī)定封鎖、消毒、強化預防注射，按規(guī)定處理好病死豬體。如果周邊有疫情發(fā)生，在做好防疫的同時還應及時搞好豬舍的消毒。生產(chǎn)區(qū)嚴格控制車輛進入，嚴格禁止外人進入，對外出車輛和人員進場要嚴格消毒。在對本場豬群進行強化免疫的同時，要供給豬群提供高營養(yǎng)的飼料。按豬的不同生長階段，科學配制飼料，保證營養(yǎng)充足，特別是保證維生素的供給[11]?？稍陲暳现屑尤牒}卜等多汁飼料和啤酒糟、餅類飼料，以改善豬飼料的口感，增加豬的食欲，增強豬的體質，提高抵抗力。

最后，做好平時藥物預防工作。對于季節(jié)性多發(fā)病進行針對性藥物預防。對已經(jīng)生病的豬群，應盡快查明病因，找出傳染源和傳播途徑，借助實驗室診斷和藥物實驗，找出主要病原和敏感藥物，鑒別好不同的呼吸道疾病，分清混合感染和單一感染，確保做到對癥下藥，對已經(jīng)查明病因的根據(jù)檢查結果將它分為病豬、可疑病豬、假定健康豬，分別進行隔離，已確定病原的可采取緊急免疫接種[12]。

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