趙敏 陳忻怡 陳振發(fā)

[摘要] 目的 探討清肺化痰通絡(luò)方對(duì)博萊霉素A5（BLMA5）所致肺纖維化大鼠的干預(yù)作用及可能機(jī)制。 方法 將Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組。模型組和干預(yù)組通過氣管插管灌注BLMA5復(fù)制大鼠肺纖維化模型，對(duì)照組給予等量生理鹽水氣管灌注；對(duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃，干預(yù)組給予清肺化痰通絡(luò)方藥物灌胃。灌胃后3、7、14、28 d分別處死大鼠，采用HE和Masson染色觀察肺組織病理變化，免疫組化染色檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、 MMP-9在肺組織的表達(dá)水平。 結(jié)果 清肺化痰通絡(luò)方能顯著改善大鼠的一般身體狀況，減輕肺泡炎及肺纖維化的程度。干預(yù)組和模型組肺內(nèi)MMP-2表達(dá)在第14天達(dá)到高峰，MMP-9的表達(dá)在第7天達(dá)到高峰，且兩組同時(shí)期MMP-2、MMP-9的表達(dá)均高于對(duì)照組（P ＜ 0.05）；干預(yù)組MMP-2、MMP-9表達(dá)低于同時(shí)期模型組 （P<0.01）。 結(jié)論 清肺化痰通絡(luò)方可能通過抑制MMP-2、MMP-9在肺內(nèi)的表達(dá)，對(duì)BLMA5致肺組織纖維化起到一定的防治作用。

[關(guān)鍵詞] 肺纖維化；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2012）05（c）-0014-03

肺纖維化是多種慢性肺疾病的共同結(jié)局，表現(xiàn)為肺間質(zhì)細(xì)胞大量增殖、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 異常增生及肺組織結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，疾病早期表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡上皮細(xì)胞和基底膜的損傷是肺間質(zhì)纖維化病理過程的特征性改變，MMP-2和MMP-9可以降解肺泡壁基底膜的重要成分Ⅳ型膠原，因此，MMP-2和MMP-9在肺纖維化的發(fā)生過程中起著重要的作用。清肺化痰通絡(luò)方是全國(guó)名老中醫(yī)邱幸凡教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，在臨床應(yīng)用中取得了較好療效。本實(shí)驗(yàn)借鑒博萊霉素A5（BLMA5）誘發(fā)的大鼠肺纖維化模型，利用免疫組化法檢測(cè)肺內(nèi)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，以探討清肺化痰通絡(luò)方防治肺纖維化的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性Wistar大鼠72只，SPF級(jí)，體重（200±20）g，購(gòu)于武漢大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)藥物

清肺化痰通絡(luò)方由黃芩、瓜蔞、桃仁、地龍、黃芪、當(dāng)歸、魚腥草（購(gòu)于湖北省中醫(yī)院）組成；常規(guī)水煎后，水浴濃縮藥液至每1 mL含生藥2 g，4℃保存。將BLMA5（8 mg/支，天津太和制藥有限公司，批號(hào)：030705）制成5 mg/mL的生理鹽水溶液。MMP-2單克隆抗體（產(chǎn)品編號(hào)：ZM-0330）、MMP-9單克隆抗體（產(chǎn)品編號(hào)：ZM-0335）及Sp試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：SP-9000）由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 肺纖維化模型制作

參照文獻(xiàn)[1]，將大鼠麻醉，趁動(dòng)物吸氣瞬間，在額鏡的直視下迅速將焊錫制成圓頭的12號(hào)腰穿針頭，通過聲帶插入氣管約3~4 cm，緩慢注入BLMA5生理鹽水溶液1 mL/kg。立即將大鼠直立旋轉(zhuǎn)。

1.4 動(dòng)物分組及處理方法

將72只大鼠隨機(jī)分為三組：① 模型組（24只）：造模2 h后，生理鹽水灌胃，15 mL/（kg·d）；② 干預(yù)組（24只）：造模2 h后，清肺化痰通絡(luò)方水煎劑灌胃，15 mL/（kg·d）；③對(duì)照組（24只）：不造模，生理鹽水灌胃，15mL/（kg·d），灌胃前禁食4 h，不禁水。以上各組動(dòng)物分別在實(shí)驗(yàn)第3、7、14、28天各處死6只。

1.5 標(biāo)本采集及處理

經(jīng)0.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射麻醉后，稱重；頸動(dòng)脈放血處死，10％甲醛溶液固定右肺上葉，制作石蠟切片，用于HE染色和Masson染色及肺組織MMP-2和MMP-9表達(dá)檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 病理染色分析依據(jù)Szapiel等[2]方法，確定肺泡炎及肺纖維化程度。①肺泡炎分級(jí)，0分：無明顯病變；1分：輕度肺泡炎，病變占全肺20%以下；2分：中度肺泡炎，病變局限在全肺20%~50%；3分：彌漫性肺泡炎，病變范圍超過50%。②肺間質(zhì)纖維化分級(jí)，0分：無肺間質(zhì)纖維化；1分：輕度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍局限在全肺20%以下；2分：中度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍占全肺20%~50%；3分：重度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍超過50%，肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。

1.6.2 免疫組織化學(xué)分析Sp法測(cè)定肺組織的MMP-2和MMP-9表達(dá)，采用HUMIAS-2000醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果定量分析。每張切片在高倍視野（×400）下隨機(jī)選擇不相重疊的5個(gè)視野，細(xì)胞核為藍(lán)色，MMP-2和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色，陰性對(duì)照片以PBS替代MMP-2和MMP-9。測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度，觀察MMP-2和MMP-9免疫陽(yáng)性細(xì)胞的分布，以反映各組肺組織中MMP-2和MMP-9表達(dá)的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，三組間比較采用單因素方差分析，用q檢驗(yàn)進(jìn)行不同組間的兩兩比較，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清肺化痰通絡(luò)方對(duì)肺纖維化大鼠肺組織的影響

2.1.1 肉眼觀察對(duì)照組可見大鼠肺呈粉紅色，表面光滑，彈性良好。模型組第3、7天可見大鼠雙肺呈鮮紅色，有數(shù)個(gè)的散在出血點(diǎn)，體積增大，第14天雙肺可見暗紅色陳舊出血，第28天時(shí)雙肺蒼白、表面凸凹不平、體積縮小、彈性較差，硬度增加。干預(yù)組與模型組病變基本一致，但程度稍輕，肺體積略增大，彈性稍差。

2.1.2 鏡下觀察對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)正常，均未見明顯病變。模型組第3天時(shí)肺內(nèi)出現(xiàn)肺泡間隔增寬、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等急性肺泡炎改變；第7天時(shí)炎癥表現(xiàn)更明顯，鏡下見大片炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞開始增殖；第14天時(shí)肺泡炎持續(xù)加重，纖維組織開始增生；第28天肺泡炎較前有所減輕，部分肺泡腔消失，被大量成纖維細(xì)胞、增生的膠原纖維所取代，已基本呈現(xiàn)肺纖維化改變。干預(yù)組大鼠肺部病理表現(xiàn)的變化規(guī)律與模型組基本一致。三組間同時(shí)段的肺泡炎程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；干預(yù)組和模型組同時(shí)段肺泡炎程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），特別是第7天和第14天干預(yù)組肺泡炎程度較模型組輕，兩組間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。干預(yù)組和模型組在第3天肺纖維化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），三組在第7、14、28天的肺纖維化程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；第28天干預(yù)組肺纖維化程度較模型組輕，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。見表1。

2.2 三組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)比較

對(duì)照組肺組織中可見MMP-2少量陽(yáng)性表達(dá)，主要分布在肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)。模型組、干預(yù)組第3天時(shí)，肺內(nèi)MMP-2陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞均多于對(duì)照組，肺泡間隔內(nèi)可見少量成纖維細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，血管、支氣管周圍及肺泡腔鏡下內(nèi)可見大量單核巨噬細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，三組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；第7天模型組和干預(yù)組MMP-2表達(dá)明顯增強(qiáng)，可見大量肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)的成纖維細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)； 第14天模型組和干預(yù)組肺內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)，與第3、7、28天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；第28天時(shí)，模型組和干預(yù)組陽(yáng)性細(xì)胞較同組第14天時(shí)明顯減少，但仍高于對(duì)照組。見表2。

對(duì)照組肺內(nèi)可見MMP-9少量弱陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)主要分布于肺胞巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。第3天時(shí)模型組、干預(yù)組大鼠肺內(nèi)血管、支氣管周圍及肺泡腔內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；第7天模型組和干預(yù)組肺內(nèi)MMP-9表達(dá)增強(qiáng)，除支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞外，還見大量間質(zhì)內(nèi)的成纖維細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，與同組第3、14、28天比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；第14天模型組和干預(yù)組肺內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞略有減少；第28天模型組和干預(yù)組MMP-9表達(dá)較第7天時(shí)明顯減弱，但仍高于對(duì)照組（P ＜ 0.05）。干預(yù)組陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于同時(shí)段模型組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表2。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)肺纖維化臨床表現(xiàn)及病機(jī)變化將其歸為咳嗽、肺脹、喘證、氣短、肺痿、肺痹、痰飲等范疇，正氣虧虛為本，血瘀內(nèi)阻為標(biāo)，正虛邪實(shí)為其基本病機(jī)，其中，痰阻肺絡(luò)、肺陰不足、瘀血阻滯、內(nèi)閉喘脫為臨床多見的病變類型。消腫化痰通絡(luò)方中黃芩、瓜蔞為君藥，黃芩味苦寒主入肺經(jīng)，可瀉火解毒，治肺熱所致咳吐黃痰；瓜蔞藥味甘、微苦，性寒，歸肺、胃、大腸經(jīng)，清熱化痰，寬胸散結(jié)、痛瘡腫毒，兩者相伍則肺之熱清痰化而氣機(jī)調(diào)暢；魚腥草味辛，性微寒，歸肺經(jīng)具有清熱解毒、消癰排膿功效，肺萎之人久咳入絡(luò)，必兼氣虛血瘀，故以地龍、桃仁活血化瘀、通絡(luò)，且地龍性寒味咸，善下行可平抑上逆之肺氣而止咳平喘；佐以黃芪、當(dāng)歸養(yǎng)血補(bǔ)氣，與君藥相配，苦寒、甘溫并用，使肺熱得清而不傷肺津，共奏清熱化痰、止咳平喘、活血益氣之功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模大鼠均有不同程度的聳毛、活動(dòng)減少、嗜睡，少吃等癥狀。造模初期可見大鼠體重明顯下降，約3 d后逐漸緩解，其中，干預(yù)組體重恢復(fù)較快，第28天時(shí)體重已與空白對(duì)照組相近，而模型組體重恢復(fù)較慢，第28天時(shí)仍明顯低于對(duì)照組。通過HE光鏡觀察模型組早期即出現(xiàn)肺泡炎，14 d后以肺纖維化病變?yōu)橹鳎?8 d出現(xiàn)典型的肺纖維化改變，符合肺纖維化的病理改變過程[3]，提示造模成功。干預(yù)組肺泡炎程度明顯的輕于模型組，提示清肺化痰通絡(luò)方可以減輕早期肺泡炎的改變，第14、28天干預(yù)組肺纖維化程度輕于同時(shí)段的模型組。提示清肺化痰通絡(luò)方可以減輕模型動(dòng)物的癥狀，并在肺組織結(jié)構(gòu)上減輕和延緩纖維化的發(fā)生。

組織纖維化的發(fā)生是由于ECM代謝失衡，打破了臟器原有的組織結(jié)構(gòu)，纖維結(jié)締組織大量增生的結(jié)果[4]。ECM包括纖維性成分、連接蛋白和間質(zhì)成分，主要為糖胺聚糖等，其對(duì)細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用，合成和降解這些蛋白質(zhì)的ECM代謝酶可分為基質(zhì)金屬蛋白酶類 （MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）。MMPs的明膠酶（MMP-2、MMP-9）主要降解Ⅳ膠原纖維、纖維連接蛋白、肺基膜等成分，由于肺基膜及結(jié)構(gòu)支架的損傷與肺纖維化密切相關(guān)，因此，MMPs在肺纖維化發(fā)生中的作用日益受到重視[5]。有報(bào)道MMP抑制劑巴馬司他等能降低MMP-9活性，抑制TNF-α和TGF-β1釋放，減輕動(dòng)物模型的肺纖維化[6-7]。Lemjabbar等[8]測(cè)定了肺間質(zhì)纖維化患者支氣管肺泡灌洗液中蛋白和MMP-2 mRNA的表達(dá)，顯示激素及免疫抑制劑治療可以降低肺內(nèi)MMP-2表達(dá)。上述研究均表明損傷肺組織可能通過持續(xù)性高表達(dá)MMPs，使基膜不可逆性損傷斷裂，阻礙新生上皮組織重構(gòu)正常肺泡腔，最終導(dǎo)致肺纖維化。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，第3天開始模型組和干預(yù)組肺內(nèi)MMP-2、MMP-9的表達(dá)均開始增加，模型組和干預(yù)組MMP-9在第7天時(shí)已經(jīng)達(dá)到高峰，然后干預(yù)組快速下降，到第28天時(shí)MMP-9水平基本接近正常，模型組在第7天出現(xiàn)MMP-9表達(dá)高峰，第14、28天也出現(xiàn)明顯的下降，但是28天時(shí)MMP-9的水平仍高于對(duì)照組。肺纖維化大鼠在造模的第3~14天以肺泡炎的病理改變?yōu)橹?，提示MMP-9可能與早期上皮基底膜損傷有關(guān)，參與了細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解。干預(yù)組的MMP-9明顯下降，且在第14天時(shí)MMP-9的表達(dá)明顯低于模型組，推測(cè)清肺化痰通絡(luò)方可能是通過抑制MMP-9表達(dá)，從而延緩、減輕早期肺泡炎的發(fā)生。模型組和干預(yù)組MMP-2在第14天時(shí)達(dá)到高峰，然后緩慢下降，第28天時(shí)，模型組和干預(yù)組仍高于對(duì)照組。第14、28天時(shí)以肺纖維化為主要病變，提示MMP-2則可能在肺泡上皮細(xì)胞的再生與肺組織的異常修復(fù)中起重要作用。第14、28天MMP-2在干預(yù)組的表達(dá)低于模型組，且干預(yù)組肺纖維化程度比模型組輕，提示清肺化痰通絡(luò)方通過延緩或者抑制MMP-2表達(dá)，達(dá)到延緩以及抑制肺纖維化的目的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，BLMA5誘導(dǎo)的肺纖維化模型在不同時(shí)期MMPs的表達(dá)不同，早期病變肺組織以MMP-9的增加為主，晚期則以MMP-2增加為主，與有關(guān)報(bào)道一致[9]。清肺化痰通絡(luò)方可能通過抑制MMP-9在肺纖維化大鼠肺內(nèi)的表達(dá)，減輕早期的肺泡炎，抑制MMP-2的表達(dá)，延緩和抑制后期肺纖維化的發(fā)生。

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（收稿日期：2012本文編輯：程銘）