馬一杰 陳貝貝 尚藝曼 陳小兵 羅素霞

[摘要] microRNA（微小RNA）是一類長度為17～25nt的單鏈非編碼RNA，能夠識別特定的目標 mRNA，并在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達起負調(diào)控作用。血液、糞便及大腸癌組織中的 microRNA 可以輔助診斷大腸癌和預測疾病復發(fā)。特異microRNA 的過度表達或沉默與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。組織和血液中特異 microRNA 的表達不同，提示了其在大腸癌早期發(fā)現(xiàn)和篩檢中的應用前景。眾多研究提示，microRNA與大腸癌的化療藥物敏感性有關。此外，microRNA 在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用表明其可能是重要的基因治療目標。

[關鍵詞] microRNA；大腸癌；表達水平

[中圖分類號] R735.34[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2012）05（c）-0008-04

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。近年來，盡管大腸癌診治水平不斷提高，但是其5年生存率并未明顯提高，究其原因在于大腸癌發(fā)生發(fā)展的確切機制仍未完全闡明。因此，進一步闡明大腸癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機制是目前的研究熱點。microRNA作為新發(fā)現(xiàn)的一類非蛋白質(zhì)編碼RNA，近年來受到廣泛關注。本文對microRNA在大腸癌診治中的研究進展做一綜述，旨在為大腸癌診治提供新的思路。

1 microRNA簡介

microRNA分子是近幾年來分子生物學和遺傳學領域的研究熱點。在細胞的增殖、分化、凋亡等生命過程中起到重要的調(diào)控作用。生物學研究表明，microRNA是一類在進化上高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，長17～25 nt，能夠通過多種途徑及通路在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。眾多研究提示，microRNA在多種惡性腫瘤的演進過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣的作用[1-5]，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要分子之一。microRNA基因先進行轉(zhuǎn)錄，形成長約幾百至幾千個核苷酸的初級產(chǎn)物（pri-microRNA），然后在核內(nèi)Drosha酶的作用下被切割成microRNA前體（pre-microRNA），后者與轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5結(jié)合并被轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，一種叫Dicer的核酶能夠識別前體microRNA并在RNA 聚合酶Ⅲ及解旋酶的參與下將其加工成為成熟的單鏈microRNA，進入核蛋白復合體并參與形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），后者能夠與靶mRNA完全或不完全匹配結(jié)合，直接切割或抑制其翻譯表達，在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控基因的表達， 并通過多種信號轉(zhuǎn)導通路在細胞生長、增殖、發(fā)育和凋亡過程中扮演重要角色[6]。

2 microRNA在大腸癌診斷中的價值

隨著現(xiàn)代醫(yī)學在腫瘤生物標志物和治療中的卓越發(fā)展，許多癌癥已經(jīng)不再意味著死亡。腫瘤標志物在腫瘤的早期診斷和治療方面發(fā)揮著重要作用。腫瘤標志物不僅有助于判斷患者的癌癥類型，還能在癌癥早期尚未惡化、轉(zhuǎn)移之前及早確診。更重要的是，腫瘤標志物還能告訴臨床醫(yī)生，患者會對哪種治療方法有效以及病情是否被控制。在這方面，microRNA是一種優(yōu)秀的新型腫瘤標志物候選者。

目前已報道的研究提示，microRNA表達水平的檢測不但可用于腫瘤和正常組織的鑒別，還可以輔助對腫瘤進行分期。microRNA廣泛存在于體液，尤其是血液和糞便中的microRNA，可能成為一種極具臨床應用前景的腫瘤標志物。最新研究表明，在人體血清當中，腫瘤源性microRNA 不受內(nèi)源性核糖核酸酶的影響，并以相當穩(wěn)定的形式存在[7]。Chen等[8]應用RT-PCR法檢測大腸癌患者與健康志愿者血清中microRNA含量，發(fā)現(xiàn)有69種健康志愿者血清里所沒有的microRNA特征性的出現(xiàn)于大腸癌患者血清樣本中。Monzo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與對應的正常組織相比，Ⅰ期和Ⅱ期結(jié)腸癌分別有28種和64種的miRNA表達有差異。如果能基于血液建立起與健康人年齡匹配的miRNA表達譜，不同時期的結(jié)腸癌或許能得到準確的判斷。 根據(jù)miRNA表達量與病情嚴重程度的相關模型，血液miRNA的表達量或許可以預測結(jié)腸癌的時期。 此外， 根據(jù)血液檢測的獨特miRNA表達譜可對具有高風險的腸息肉患者進行定期監(jiān)測，這將減少息肉切除術后患者結(jié)腸鏡多次檢查的痛苦。

另外，Link等[10]通過對大腸癌、大腸腺瘤患者及正常志愿者大便樣本中miR-21的檢測發(fā)現(xiàn)，大腸癌及大腸腺瘤患者大便樣本中的miR-21和miR-106的表達水平與正常志愿者存在差異，提示大便樣本中microRNA表達水平的檢測可能成為一種嶄新而有效的非入侵性大腸癌篩檢試驗。

但是，由于大腸癌microRNA研究剛剛起步，且具有腫瘤特性的microRNA在大腸癌中的表達存在交叉性和多樣性，因而特異性和敏感性均理想的microRNA迄今尚未找到，單獨用一個microRNA 來作為大腸癌敏感的診斷生物標志物仍不合適。多種microRNA聯(lián)合應用檢測有望成為一種行之有效的大腸癌輔助診斷指標。

3 microRNA在大腸癌治療中的應用前景

3.1 microRNA與放化療

放化療是現(xiàn)今大腸癌綜合治療中的重要組成部分，大量國內(nèi)外研究表明，microRNA與大腸癌的放化療效果密切相關。程贏等[11]在實驗中檢測輻射前后不同組織、細胞中miR-34a的表達量及細胞活力，并且在腫瘤細胞U87MG中轉(zhuǎn)染miR-34a mimics上調(diào)miR-34a的表達并檢測其細胞活力，在正常細胞HEK293中轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitors下調(diào)miR-34a的表達水平并檢測其細胞凋亡率，實驗結(jié)果表明：輻射敏感性高的細胞照后miR-34a的表達上調(diào)幅度更大，上調(diào)miR-34a表達水平對腫瘤細胞U87MG有明顯的輻射增敏作用，下調(diào)miR-34a表達對正常細胞HEK293有明顯的輻射防護作用。這提示細胞輻射敏感性與miR-34a的表達水平正相關。

Tazawa等[12]在實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能通過調(diào)節(jié)E2F信號通路對腫瘤細胞增殖發(fā)揮抑制作用。在經(jīng)阿霉素處理后的大腸癌細胞系HCT116和RKO中，miR-34家族的miR-34a、 miR-34b、miR-34c均明顯增高。實驗還發(fā)現(xiàn)，miR-34a在阿霉素應用后的表達增高呈時間依賴性，且其在阿霉素治療中發(fā)揮作用可能與P53活化有關。

Rossi等[13]以大腸癌細胞系HT-29和HCT-11為實驗對象，分別檢測了未經(jīng)5-FU處理和經(jīng)過5-FU處理的細胞系microRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)其中包括miR-19a、miR-20、miR-21在內(nèi)的17種表達上調(diào)，而 miR-200b、miR-210、miR-224表達下調(diào)。目前多項研究表明，大部分microRNA通過調(diào)節(jié)多種信號通路參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展，推測5-FU可能通過調(diào)節(jié)microRNA的表達水平從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.2 microRNA與大腸癌的藥物敏感性

腫瘤的耐藥機制非常復雜，藥物的處置、藥物靶點的改變、細胞修復和細胞死亡通路等均與之密切相關。目前研究較多的主要包括與藥物外排相關的能量依賴型轉(zhuǎn)運體，如P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白、DNA 修復系統(tǒng)如錯配修復、細胞凋亡相關分子及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶等。這些關鍵基因發(fā)生的一系列遺傳或表觀遺傳上的改變是原發(fā)性或獲得性耐藥發(fā)生的主要機制之一。此類改變包括基因缺失、突變、轉(zhuǎn)置、擴增、DNA的異常甲基化以及microRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等多種方式[14]。其中， microRNA 的表觀遺傳學調(diào)控作用成為腫瘤研究領域一個越來越熱的研究對象。

Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在HCT-116p53+/+ and HCT-116p53-/-細胞系中轉(zhuǎn)染anti-miR-31后，細胞系中miR-31的表達水平分別降至原來的44.1%和67.8%，但是MTT測定法顯示單獨轉(zhuǎn)染anti-miR-31并不能影響HCT-116p53+/+ and HCT-116p53-/-細胞系的增殖，然而當聯(lián)合應用5-FU之后，轉(zhuǎn)染anti-miR-31的實驗組與未轉(zhuǎn)染anti-miR-31的5-FU應用陰性對照組相比，這兩個細胞系早期細胞增殖明顯受到抑制，且游走細胞減少50%，提示抑制miR-31能夠提高腫瘤細胞對5-FU的早期敏感性，且能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Nicola等[16]同樣發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)接受5-FU治療的患者體內(nèi)miR-21表達增加，且通過對接受5-FU 或其類似物治療的Ⅱ、Ⅲ期大腸癌患者進行回顧性研究發(fā)現(xiàn)，miR-21表達水平與5-FU的療效密切相關，提示miR-21的過表達與Ⅱ、Ⅲ期大腸癌患者對5-FU的原發(fā)性和獲得性耐藥有關，且很可能是通過下調(diào)MMR（hMSH2或hMSH6）完成這一耐藥機制。microRNA影響化療藥物敏感性的可能機制見圖1。

microRNA 突變通過改變藥物吸收、代謝、分布和藥物靶標修復、細胞凋亡等通路中基因的表達水平影響藥物的臨床效果。

3.3 靶向microRNA的基因療法

miRNA 的表達與功能受到轉(zhuǎn)錄因子、多核苷酸多態(tài)性及其 RNA 編輯等多種因素的調(diào)節(jié)。表觀遺傳學變化通過影響 miRNA 基因從而調(diào)節(jié)miRNA表達。

基因的高度甲基化被認為是表觀遺傳的重要決定因素之一。Lugambio 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏 DNMT1和DNMT3b 基因的腫瘤細胞中有18個miRNA 呈現(xiàn)高表達。啟動子區(qū)高甲基化使 miRNA-124 基因沉默，而去甲基化狀態(tài)同時伴有致癌因子CDK6的活化和抑癌基因Rb磷酸化。Lujambio 等[18]還發(fā)現(xiàn)，miRNA-148a和 miRNA-34b/c 在結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等腫瘤細胞中低表達，相應的DNA啟動子區(qū)CpG島處于高甲基化狀態(tài)，應用甲基化抑制劑可以上調(diào)這些特定的miRNA 在腫瘤細胞中的表達，并下調(diào)其靶基因（某些原癌基因）的表達，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。多數(shù) miRNA 可能作為腫瘤抑制因子而發(fā)揮作用。

Hu等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)miR-141作為microRNA家族中重要成員之一，其表達與SIP1蛋白的水平及大腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移呈負相關，而SIP1被認為是 miR-141的功能性靶點，從而推測miR-141通過調(diào)節(jié)SIP1抑制大腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，可能成為一種大腸癌治療的新靶點。

另外，Asangani等[20]在試驗中發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細胞系Colo206f中，PDCD4蛋白和miR-21的表達呈負相關，提示miR-21可能是大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要中間分子。靶向miR-21并抑制其表達有可能為大腸癌的治療提供一種嶄新手段。

不只是上述這些推測，有研究者將某些microRNA直接作用于大腸癌細胞從而取得了有意義的結(jié)果。吳春蓉等[21]在結(jié)腸癌細胞系 SW480中轉(zhuǎn)染合成的成熟型 miR-451，并檢測其對SW480 細胞的增殖、凋亡和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)染技術提高 miR-451 在細胞系SW480中的表達對其凋亡和增殖無明顯影響，但對其侵襲能力有抑制作用。提示miR-451能在結(jié)腸癌細胞系SW480的侵襲中發(fā)揮抑制作用。

4 microRNA和大腸癌的預后

大腸癌中microRNA的表達與大腸癌的預后密切相關。Aaron等[22]對1991~2000年入組的113例亞裔人群腫瘤組織中microRNA的表達水平進行檢測并隨訪至2005年12月31日，發(fā)現(xiàn)有37種miRNA存在異常表達。miR-20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、and miR-203的表達顯著增加， 其中miR-21在腺瘤及腫瘤組織中的含量隨腫瘤的TNM分期存在升高趨勢，且其在癌組織中的高表達與腫瘤的TNM分期及化療療效呈負相關。Slaby等[23]就miR-21、miR-31、 miR-143，miR-145這4種microRNA對29例原發(fā)性大腸癌組織樣本及6例癌周組織樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中miR-21、miR-31的表達上調(diào)，而 miR-143和miR-145的表達下調(diào)。其中，miR-21的高表達與大腸癌患者的淋巴結(jié)受累、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關。Strillacci等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-101在大腸癌細胞系及大腸癌腫瘤組織中表達下調(diào)，且與COX-2的表達呈負相關。尤其是大腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者腫瘤組織內(nèi)miR-101的表達明顯下降，提示miR-101可能在人類大腸癌的遠處轉(zhuǎn)移中充當重要角色。

此外，Schepeler等[25]通過實驗結(jié)合平均75個月的隨訪發(fā)現(xiàn)，高表達miR-320或miR-498的Ⅱ期結(jié)腸癌患者無病生存率（disease free survial，DFS）與低表達者具有顯著性差異，提示miR-320或miR-498的表達水平與Ⅱ期結(jié)腸癌患者的預后有關。這些實驗結(jié)果都預示著miRNA可能為大腸癌的預后判斷提供一種嶄新而有效的鑒別依據(jù)。

5 展望

綜上所述，microRNA與大腸癌的發(fā)生發(fā)展、藥物敏感性及復發(fā)轉(zhuǎn)移等密切相關，為大腸癌的診斷、治療及預后提供新思路。目前的診斷技術大多具有較大的創(chuàng)傷性，其臨床應用受到限制。而血漿或大便microRNA作為腫瘤診斷和預后分子標志物不僅具有創(chuàng)傷小、方法便捷、準確的優(yōu)勢，而且還可能改進和提高疾病診斷、癌癥分類、化療療效及預后估計的精度。血清 microRNA作為新興的腫瘤分子標志物在未來的大腸癌臨床診斷和治療中將會有更好的應用前景。

眾多研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療藥物發(fā)揮作用中起到重要作用，這提示我們，靶向miRNA的基因療法可能幫助遏制具有高風險的腸息肉患者大腸癌的發(fā)生，并且在控制其進展和轉(zhuǎn)移以及提高化療藥物敏感性方面發(fā)揮促進作用。這為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供了嶄新的思路。雖然目前試驗發(fā)現(xiàn)miRNA有一定的應用前景，但是這還需要進行更深一步的研究驗證。

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（收稿日期：2011-12-06本文編輯：馮婕）