李全歡 徐志飛 段越敏 邵 恒 金明玉

吉林延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002

血管性癡呆 (Vascular dementia，VaD)是由于腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙臨床綜合征。VaD是引起老年性癡呆的第二病因，其研究近年來備受關(guān)注。朝醫(yī)方麥門冬遠(yuǎn)志散出自《東醫(yī)壽世保元》。由麥門冬、遠(yuǎn)志、石菖蒲、五味子等4味藥組成，具有醒肺調(diào)氣，聰耳明目的功效。本方屬于太陰人方劑，根據(jù)太陰人肝大肺小的臟器特點(diǎn)和血濁氣澀及肺虛過燥的病機(jī)特點(diǎn)，以醒肺調(diào)氣，聰耳明目為主要治療原則，對(duì)學(xué)習(xí)記憶力減退有良好的預(yù)防與治療作用。本研究主要用頸背部皮下注射10%D—半乳糖制備癡呆模型小鼠，利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善變化，并進(jìn)行腦丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的測(cè)定。探討朝醫(yī)麥門冬遠(yuǎn)志散對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用，并初步探討其作用機(jī)制，并為VaD的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

麥門冬、遠(yuǎn)志、石菖蒲及五味子均由延邊中醫(yī)醫(yī)院提供。SOD試劑和MDA試劑均由南京建成生物工程研究所提供，D-半乳糖，購(gòu)自sigm a公司，用生理鹽水配成100g/L的濃度。儀器:Morris水迷宮為上海吉量軟件有限公司產(chǎn)品，紫外分光光度儀為上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品，離心機(jī)為SIGMA65308美國(guó)生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用昆明種2月齡清潔級(jí)小鼠40只，雌雄各半，體重20±2 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常組、模型組、麥門冬遠(yuǎn)志散低劑量組(50mg/kg)和麥門冬遠(yuǎn)志散高劑量組(200mg/kg)，共4組，每組10只。

1.3 動(dòng)物模型制備

模型組、麥門冬遠(yuǎn)志散低、高劑量組，每日給小鼠頸背部皮下注10%D-半乳糖0.25 mL/20 g，連續(xù)6周，正常組注射等量的生理鹽水。從第1天開始，麥門冬遠(yuǎn)志散2個(gè)劑量組 (低、高劑量)，分別按為50、200 mg/kg的劑量灌胃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，模型組及正常組灌等量的生理鹽水。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試

采用改良的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，參考聶榮慶等［1]的方法，水迷宮為圓形水槽，直徑60 cm，高17 cm，水深11 cm，測(cè)試過程中室溫保持在18～22℃。在槽壁上等距離地標(biāo)記4個(gè)點(diǎn)分別為NESW，這4個(gè)點(diǎn)作為實(shí)驗(yàn)起始點(diǎn)。在NW象限中間固定位置處放一透明玻璃平臺(tái)，高9.5 cm，直徑6 cm，使其低于水面1.5 cm。在水面覆蓋一層大小相似，直徑約為1.5 mm的泡沫顆粒屑，使平臺(tái)不可見。水槽周圍有豐富的固定不變的參照物 (包括試驗(yàn)者本身)，以供小鼠定位。參考Williams等［2]的方法，共訓(xùn)練5 d，分為每天上午及下午兩個(gè)時(shí)段，每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練開始將平臺(tái)放在NW象限的固定位置處，將小鼠從槽壁4個(gè)起始點(diǎn)分別放入水槽中，記錄從放入小鼠到小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間 (逃避潛伏期，escape latency)，4次訓(xùn)練分別從不同的起點(diǎn)放入小鼠，小鼠找到平臺(tái)后，讓小鼠在平臺(tái)上休息30 s，再進(jìn)行下1次訓(xùn)練。如小鼠120 s仍找不到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將小鼠放置于平臺(tái)上，逃避潛伏期記為120 s，也讓小鼠在平臺(tái)上休息30 s。

1.5 腦SOD、MDA檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取同一部位的腦組織150 mg，吸干水漬后置入液氮保存。測(cè)定前稱體質(zhì)量，剪取適量心肌組織塊，研磨成100 g/L勻漿，低溫離心，取上清液，測(cè)定上清液中SOD、MDA含量。SOD測(cè)定采用羥胺法，MDA測(cè)定采用TBA法，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 11.50統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以±SD表示，單因素方差分析，組間進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 麥門冬遠(yuǎn)志散對(duì)癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

模型組逃避潛伏期延長(zhǎng)，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，灌胃給予麥門冬遠(yuǎn)志散后，逃避潛伏期縮短，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。

2.2 麥門冬遠(yuǎn)志散對(duì)癡呆模型小鼠腦組織 SOD活性、MDA含量的影響

模型組小鼠腦組織SOD活性降低，MDA含量升高，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，麥門冬遠(yuǎn)志散低、高劑量組中SOD活性增加，MDA含量下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。結(jié)果見表1。

表1 麥門冬遠(yuǎn)志散對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶和腦組織SOD活性、MDA含量的影響 (n=10，±SD)

表1 麥門冬遠(yuǎn)志散對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶和腦組織SOD活性、MDA含量的影響 (n=10，±SD)

注:與模型組比較*P＜0.01;與正常組比較△P＜0.01。

組別 藥物劑量(mg/kg)潛伏期(s)腦組織SOD活性(U/mg prot)腦組織MDA含量(nmol/mg prot)- 21.4 ±5.50 210.35 ±17.93 16.56 ±0.78模型組 - 32.6 ±7.15△ 135.98 ±8.02△ 19.80 ±1.17△正常組麥門冬遠(yuǎn)志散低劑量組 50 25.4 ±5.15* 155.52 ±9.17* 18.31 ±0.73*麥門冬遠(yuǎn)志散高劑量組 200 23.8 ±5.34* 187.91 ±10.36* 17.47 ±0.87*

3 討論

隨著人類物質(zhì)文明和生活水平的不斷提高，人的壽命普遍延長(zhǎng)，但腦的學(xué)習(xí)記憶功能卻逐漸衰退。近年來由于朝醫(yī)藥在益智方面具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在益智健腦的保健藥物開發(fā)上應(yīng)用非常廣泛。老年癡呆的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系，正常機(jī)體的活性氧生成和消除趨于平衡狀態(tài)。若發(fā)生失衡則機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而腦組織由于其耗氧量大，不飽和脂類含量高，活性氧消除系統(tǒng)水平較低及活性氧產(chǎn)生的途徑多于其他系統(tǒng)或器官，因此大腦是氧自由基優(yōu)先攻擊的靶器官。氧自由基是物質(zhì)代謝的有氧代謝產(chǎn)物，它可以造成各種組織損傷，自由基與抗自由基之間的不平衡是衰老的重要原因之一，也是誘發(fā)老年癡呆神經(jīng)病理過程的主要原因。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腦組織SOD活性明顯下降，MDA含量顯著增加。SOD是清除氧自由基最有效的酶［3]，SOD活性高低及MDA含量多少可間接反映體內(nèi)自由基清除能力。D-gal癡呆模型小鼠灌胃麥門冬遠(yuǎn)志散后，學(xué)習(xí)記憶能力明顯優(yōu)于模型組小鼠，SOD活性升高，MDA含量減少，表明麥門冬遠(yuǎn)志散可減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、降低脂質(zhì)過氧化物的含量、提高機(jī)體抗氧化能力和清除自由基能力，這也可能是麥門冬遠(yuǎn)志散提高D-gal癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、改善老年癡呆癥狀的作用機(jī)制之一。

［1]聶榮慶，張進(jìn)，胡國(guó)柱，等.腦細(xì)胞活性因子對(duì)消化素學(xué)習(xí)、記憶能力的影響［J].中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2002，11(5):488-489.

［2]Williams M T，Morford L L，Wood S L，et al.Developmental D-methamphetamine treatment selectively induces spatial navigation impairments in reference memory in the Morris water maze while sparing working memory ［J].Synapse，2003，48(3):138-148.

［3]崔旭，李文彬，張炳烈，等.自由基損傷與D-半乳糖所致細(xì)胞老化關(guān)系［J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，20(1):24-26.