蘇 艷, 段繼周, 段東霞, 藺存國, 張 杰, 侯保榮, 楊東方

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海201306; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島266071; 3. 青島雙瑞防腐防污工程有限公司, 山東 青島266101)

生物污損對人類開發(fā)和利用海洋帶來巨大損失[1]。生物污損的早期階段是微生物附著和生物膜形成階段[2]。海洋微生物附著過程包括細(xì)菌起始黏附、生物膜黏附期、生長期、成熟和剝落期等4個(gè)階段[3-5]。首先,有機(jī)分子和少量細(xì)菌黏附在物體表面[6], 在化學(xué)鍵合、靜電作用、機(jī)械聯(lián)鎖或擴(kuò)散作用下進(jìn)行黏附[7],也會(huì)在剝離、平面剪切、非平面剪切等作用下從表面脫落[8], 所以此時(shí)為可逆附著階段; 然后微生物利用自身分泌的聚合物在表面牢固黏附, 進(jìn)入不可逆附著階段; 不可逆附著后, 生物膜繼續(xù)生長, 經(jīng)過幾天或數(shù)周時(shí)間到達(dá)成熟和剝落期[9-10]。微生物在材料表面的附著、固定是一個(gè)十分復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程, 受很多因素的影響。探究不同材料表面污損微生物的附著差異是研究生物污損的基礎(chǔ)。Berntsson等[11-12]研究表明, 附著密度隨粗糙度相關(guān)參數(shù)值的增加而下降并與疏水性呈正相關(guān)。Granhag等[13]發(fā)現(xiàn), 表面特征會(huì)影響孢子在表面的黏接強(qiáng)度, 而且潤濕性也決定著附著生物與物體表面之間的實(shí)際接觸面積和吸附強(qiáng)度[14-16]。研究還表明, 微生物在材料表面的附著情況也受基體成分及各種環(huán)境因素(鹽度、溫度、酸堿度、營養(yǎng)鹽等)的影響[17-18]。

雖然微觀尺度的附著已得到了廣泛探討[19-21],但現(xiàn)有研究大多只針對導(dǎo)電性金屬或不導(dǎo)電的聚合材料, 尚缺乏這兩類材料的對比研究。為此, 本文利用表面熒光顯微鏡對 4種材料試片上的附著細(xì)菌進(jìn)行了定量描述, 初步分析了細(xì)菌在不同材料表面的附著情況及材料表面不同微生物的附著差異, 并初步探討了影響微生物附著的主要因素。

1 材料與方法

1.1 測試材料

實(shí)驗(yàn)采用大小20 mm×20 mm×2 mm的 316L不銹鋼試片、載玻片用玻璃試片、聚氯乙烯試片(Polyvinyle Chloride, PVC)和有機(jī)硅試片(Silastic T-2)。有機(jī)硅試片由道康寧T2(DOW Corning Corporation, USA)制作而成, 先由普通玻璃制作成 20 mm×20 mm×2 mm的模具, 然后在模具底面放置一層2000目的砂紙, 將 Silastic T-2 base translucent和silastic T-2 curing agent以10:1混合, 攪拌均勻后倒入模具, 1d后有機(jī)硅試片即可脫模而成。

實(shí)驗(yàn)中的316 L不銹鋼試片、玻璃試片及PVC試片均分別用 1000目、1200目、2000目的水砂紙依次進(jìn)行打磨, 打磨順序從低逐漸到高, 循序漸進(jìn),每更換一個(gè)目數(shù), 試片打磨方向與上一號方向垂直90°。然后用無水乙醇浸泡316 L不銹鋼試片、玻璃試片、PVC試片及有機(jī)硅試片, 再用超聲波清洗, 取出晾干, 紫外滅菌12 h。

1.2 細(xì)菌菌株及其培養(yǎng)條件

試驗(yàn)采用 3種典型的附著性微生物作為供試菌株, 包括銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosaPAO1簡稱P.aeruginosaPAO1)來自于日本東京工業(yè)大學(xué); 大腸桿菌JM109菌株(Escherichia coliJM109簡稱E.coliJM109)來自于香港大學(xué); 希瓦氏菌Shewanella oneidensisMR-1(S.OneidensisMR-1)菌株來自于浙江大學(xué)。

配制LB培養(yǎng)基, 調(diào)pH至7.0, 121℃滅菌30 min,接種P.aeruginosaPAO1和E.coliJM109微生物菌株,置于 37℃的振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng); 配制低鹽培養(yǎng)基(LLB), 調(diào) pH 至 7.0, 121℃滅菌 30min, 接種S.oneidensisMR-1菌株置于30℃的振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中用到的培養(yǎng)基LB和LLB的組分列于表1。

表1 LB和LLB培養(yǎng)基的組成Tab. 1 The composition of medium LB and LLB

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 表面形貌觀測和接觸角測量

利用三維視頻顯微鏡(型號: KH-1300)和靜態(tài)接觸角測試儀(型號: CAM100)測量316L不銹鋼、玻璃、PVC、有機(jī)硅(Silastic T2)4種材料表面的表面形貌和靜態(tài)接觸角。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液(PBS)配制: 用電子分析天平準(zhǔn)確稱取 NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, Na2HPO41.44 g,KH2PO40.44 g溶于1 L蒸餾水中, 121℃滅菌30 min。

戊二醛固定液配制: 將50%的戊二醛用PBS稀釋10倍配成5%的戊二醛溶液。

DAPI染色液配制: 暗處準(zhǔn)確稱取0.001 g 4,6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(DAPI), 溶于1mL無菌三蒸水中制成1 g/L的DAPI母液, -20℃避光凍存。使用的時(shí)候, 先取出放在 4℃下溶解, 然后用 PBS逐級稀釋103倍配制成1mg/L的DAPI染色液, 4℃避光保存。

1.3.3 掛片實(shí)驗(yàn)

將過夜培養(yǎng)的菌液2～4℃下6 000 r/min冷凍離心5 min, 棄去上清用PBS清洗1～2次, 將離心管中沉淀的菌細(xì)胞在PBS中懸浮, 利用熒光顯微鏡計(jì)數(shù),制成終濃度 1×107cfu /mL的菌液。將紫外滅菌的316L不銹鋼、PVC、玻璃和有機(jī)硅(Silastic T2)試片浸泡在菌液中(3次重復(fù)試驗(yàn)), 37℃下置于150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 熒光顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)

試片在菌液中培養(yǎng), 分別于不同采樣時(shí)間(如1、3、6、24、48、72 h)取出試片, PBS沖洗以除去未黏附細(xì)胞, 5%戊二醛固定30 min。取出試片, PBS清洗2～3次, 1mg /L的DAPI染色10 min, PBS沖洗2～3次, 于熒光顯微鏡(德國ZEISS)下觀察不同材料表面對細(xì)菌的黏附數(shù)量, 拍照計(jì)數(shù), 并利用 Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌在材料表面隨時(shí)間變化的附著過程

以S.oneidensisMR-1菌株在有機(jī)硅試片表面的附著情況為例, 說明細(xì)菌附著隨時(shí)間變化的規(guī)律。圖1是有機(jī)硅試片在1×107cfu /mL的S.oneidensisMR-1菌液中掛片, 在附著不同時(shí)間后的熒光顯微鏡照片。

圖2是有機(jī)硅材料(Silastic T2)在1×107cfu /mL的S.oneidensisMR-1菌液中掛片的熒光顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果, 利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析得到試片表面隨時(shí)間變化附著量如圖 2所示。開始呈現(xiàn)上升趨勢, 在附著時(shí)間3 h時(shí)達(dá)到峰值, 隨之出現(xiàn)短暫的下降趨勢, 之后又進(jìn)入上升的附著階段且細(xì)菌在試片上的附著數(shù)量不斷增加, 并逐漸形成生物膜體系。

2.2 不同材料試片上污損生物的附著情況

4種不同材料試片上E.coliJM109、P.aeruginosaPAO1、S.oneidensisMR-1三種菌株的附著情況如圖3～圖5所示。

相同溫度條件下, 不同種類材料(玻璃、316L不銹鋼、PVC、有機(jī)硅)試片在1×107cfu /mL的微生物(S.oneidensisMR-1、E.coliJM109、P.aeruginosaPAO1)菌液中進(jìn)行的掛片, 結(jié)果如圖3～5所示, 可以看出,材料表面細(xì)菌的附著在達(dá)到不可逆黏附階段后, 不同材料對污損細(xì)菌的附著量大小呈現(xiàn)如下趨勢:316L不銹鋼片>PVC>玻璃, 玻璃材料較其他三種材料表現(xiàn)出較好的防污損特性, 有機(jī)硅材料(Silastic T2)表面細(xì)菌的附著量時(shí)而大于或小于另外三種材料的表面附著量, 具有很大的變動(dòng)性, 表明材料自身具有不確定特性。

圖1 S.oneidensis MR-1在有機(jī)硅試片表面的附著規(guī)律Fig. 1 The attachment regular pattern of S.oneidensis MR-1 on organic silicon (Silastic T-2)material

圖2 S.oneidensis MR-1在有機(jī)硅試片上隨時(shí)間變化的附著情況Fig. 2 The attachment of S.oneidensis MR-1 on organic silicon (Silastic T-2)material over time

圖3 E.coli JM109在不同材料表面的附著情況Fig. 3 The attachment of E.coli JM109 on different materials

圖4 P.aeruginosa PAO1在不同材料表面的附著情況Fig. 4 The attachment of P.aeruginosa PAO1 on different materials

圖5 S.oneidensis MR-1在不同材料表面的附著情況Fig. 5 The attachment of S.oneidensis MR-1 on different materials

2.3 同種材料表面不同污損生物的附著情況

同種材料表面污損生物菌株的附著情況如圖6～圖9所示。

圖6 不同細(xì)菌在玻璃材料表面的附著情況Fig. 6 The adhesion of different kinds of bacteria on glass material

圖7 不同細(xì)菌在有機(jī)硅材料表面的附著情況Fig. 7 The adhesion of different kinds of bacteria on silicone material

圖8 不同細(xì)菌在316L不銹鋼材料表面的附著情況Fig. 8 The adhesion of different kinds of bacteria on 316L stainless steel

對同種材料而言, 由圖6～圖9可以看出, 試片上附著細(xì)菌的數(shù)量呈現(xiàn)如下規(guī)律: 菌株S.oneidensisMR-1和P.aeruginosaPAO1在4種材料表面的附著面積均大于菌株E.coliJM109, 可見污損生物在材料表面的附著量跟污損細(xì)菌種類具有一定的相關(guān)性。

圖9 不同細(xì)菌在PVC材料表面的附著情況Fig. 9 The adhesion of different kinds of bacteria on PVC material

3 討論

3.1 細(xì)菌在材料表面隨時(shí)間變化的原因分析

由圖2中S.oneidensisMR-1在有機(jī)硅材料試片上隨時(shí)間變化的附著情況看,S.oneidensisMR-1在有機(jī)硅材料上的附著面積在1～3 h時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢, 在3～24 h時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢, 繼而又呈現(xiàn)上升趨勢?？梢娫?～3 h是初始附著階段, 繼而3 h左右進(jìn)入可逆附著階段, 微生物在表面的附著源于水流、生物體運(yùn)動(dòng)或這些進(jìn)程的聯(lián)合作用。S.oneidensisMR-1附著數(shù)目驟然增加的同時(shí), 由于附著的可逆性, 極易在流速的剪切力或微生物自身鞭毛的作用下脫落, 所以試驗(yàn)中細(xì)菌在短暫的數(shù)目陡增后, 數(shù)目開始減少。進(jìn)入不可逆附著階段, 只有牢固黏附的細(xì)菌才能在物體表面繼續(xù)生長并分泌大量胞外聚合物, 并在胞外聚合物的作用下使得溶液中細(xì)菌繼續(xù)黏附, 并形成生物膜。

3.2 材料表面特征與細(xì)菌特性影響微生物附著的原因分析

3.2.1 材料表面特性對細(xì)菌附著的影響

利用視頻顯微鏡測得四種材料的表面形貌, 如圖10所示。

利用靜態(tài)接觸角測試儀測得四種材料表面的靜態(tài)接觸角如圖11。

在海洋環(huán)境中, 基體材料的理化特性和表面特征均會(huì)影響附著生物的數(shù)量, 從而影響微生物在機(jī)體表面的附著并最終導(dǎo)致生物污損[22]。由實(shí)驗(yàn)中材料表面的一些參數(shù)結(jié)合附著結(jié)果可以看出, 粗糙度和材料表面的潤濕性(由材料表面靜態(tài)接觸角體現(xiàn)出,接觸角越大潤濕性越小)是影響污損微生物在材料表面附著的重要因素。由圖10和圖11可以看出經(jīng)過打磨的316L不銹鋼材料表面疏水性良好(圖11), 但依然具有較大的表面粗糙度(圖 10), 很容易被污損生物附著; 玻璃有相對較好的親水表面(圖11), 但其均勻光滑的表面形貌(圖 10), 使得細(xì)菌不易在其表面附著; 接觸角大于 98°的材料表面能都低 25 mJ/m2,因此被稱為低表面能材料[23], 有機(jī)硅材料表面接觸角接近于120°(圖11), 是典型的高疏水、低表面能材料, 但微生物在材料表面的附著情況還與表面形貌息息相關(guān), 由于在制作過程中易產(chǎn)生氣泡, 從圖 10可以明顯看出有機(jī)硅材料的表面形貌較粗糙, 且研究表明有機(jī)硅防污材料在水中短時(shí)間浸泡會(huì)使表面能逐漸增大、防污性變差[24], 這些因素都會(huì)使有機(jī)硅材料表面細(xì)菌附著量變動(dòng)較大。

圖10 4種不同材料的表面形貌Fig. 10 The surface morphology of 4 different materials

圖11 不同材料的靜態(tài)接觸角Fig. 11 The contact angle of different specimen surfaces

此外, 新的研究發(fā)現(xiàn), 有機(jī)硅材料體系中, 污損物的釋放不僅與表面能有關(guān), 而且與表面能及彈性體模量 E乘積的 1/2次方成正比[25]。實(shí)驗(yàn)中有機(jī)硅材料具有低表面能, 但具有較高的彈性模量, 兩者共同影響著細(xì)菌在有機(jī)硅材料表面的附著量, 可見除表面能外彈性模量等表面特征參數(shù)也是影響材料表面附著差異的主要因素。

3.2.2 細(xì)菌特性對微生物附著的影響

生物膜的形成除與營養(yǎng)、水動(dòng)力等外界環(huán)境因素有關(guān)外, 與細(xì)菌自身的特征也有重要關(guān)系。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (圖 6～圖 9)來看,S.oneidensisMR-1菌株和P.aeruginosaPAO1菌株均大于E.coliJM109菌株的附著面積, 這是與不同微生物種類的鞭毛著生情況密切相關(guān)的,S.oneidensisMR-1, 單生鞭毛[26]; 銅綠假單胞菌(P.aeruginosaPAO1)單端 1～2根鞭毛[27];E.coliJM109周身鞭毛[5]。端生單鞭毛的桿菌或弧菌接觸表面后, 單鞭毛黏附在表面上, 然后菌體橫臥附著在表面上, 細(xì)菌逐漸地產(chǎn)生側(cè)生鞭毛或黏多糖的纖絲, 使其在表面牢固地附著, 可避免被流體沖刷下來[28-30]。研究發(fā)現(xiàn)鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性在最初的表面黏附和后期的生物膜形成中都發(fā)揮了重要作用[31]。鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)能使細(xì)菌克服表面張力達(dá)到物體表面, 也能讓黏附的細(xì)菌個(gè)體從載體表面播散出去[32]。試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn), 三種細(xì)菌不同的鞭毛數(shù)量和著生方式, 對細(xì)菌在材料表面的附著產(chǎn)生了影響, 最終表現(xiàn)出了以上的附著量差異。

微生物胞外聚合物的產(chǎn)生及數(shù)量與微生物的種類和生長環(huán)境息息相關(guān), 雖然實(shí)驗(yàn)中條件是一致的,但微生物的最適環(huán)境條件有差異, 再加上微生物種類的差異, 所以胞外聚合物的產(chǎn)生及數(shù)量會(huì)有很大差異, 這也是導(dǎo)致微生物在材料表面附著差異的重要因素。此外, 細(xì)菌表面附著完成后, 具有群體感應(yīng)的細(xì)菌能產(chǎn)生并釋放自體誘導(dǎo)物(Autoinducer), 與周圍環(huán)境進(jìn)行信息交流, 從而改變其生理活性[5], 進(jìn)而影響細(xì)菌在材料表面生物膜的形成。

由此可見, 由于不同種細(xì)菌間鞭毛、胞外聚合物及群體感應(yīng)機(jī)制的差異, 會(huì)影響細(xì)菌在材料表面的黏附力, 進(jìn)而影響細(xì)菌在同一種材料表面附著, 因此在試驗(yàn)中表現(xiàn)為S.oneidensisMR-1菌株和P.aeruginosaPAO1菌株在材料表面的附著量均大于E.coliJM109菌株的附著。

4 結(jié)論

通過對不同污損微生物在不同材料表面的附著情況研究, 得出以下結(jié)論:

(1)污損微生物的附著需要經(jīng)過可逆附著階段、可逆到不可逆附著的過渡階段、不可逆附著階段最后到生物膜發(fā)育并最終達(dá)到成熟, 在到達(dá)不可逆附著階段之前細(xì)菌在材料表面的附著量變化不定, 達(dá)到不可逆附著階段后細(xì)菌在材料表面的附著逐漸增多并最終形成成熟的生物膜。

(2)不同種類的材料表面細(xì)菌的附著量存在差異。實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌附著量表現(xiàn)為316L不銹鋼片>PVC>玻璃, 說明不同種類材料表面的不同性質(zhì)及化學(xué)組成對污損微生物的附著具有影響, 有機(jī)硅材料接觸角大表面能低, 是典型的高疏水、低表面能材料, 可通過進(jìn)一步改良材料制作工藝來進(jìn)行海洋防污。

(3)同種材料表面不同污損細(xì)菌的附著量存在差異。實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為:S.oneidensisMR-1菌株和P.aeruginosaPAO1菌株均強(qiáng)于E.coliJM109菌株的附著, 可見不同細(xì)菌種類的自身特性(如有無鞭毛、分泌聚合物的多少及種類等)也是影響細(xì)菌附著的因素之一, 據(jù)此可以調(diào)查得出主要污損微生物種類,并有針對性的采取積極的海洋防污措施。

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