劉 鑫, 王玉峰, 曾洋洋, 王培培, 韓章潤(rùn), 吳建東, 于廣利

(1. 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院, 山東 青島 266003)

海洋動(dòng)植物中存在著種類繁多、結(jié)構(gòu)獨(dú)特的硫酸多糖[1-3], 而各種硫酸多糖具有廣泛的生物活性[4-5]。為了確定多糖結(jié)構(gòu), 探討多糖活性與其硫酸基含量之間關(guān)系, 對(duì)其進(jìn)行脫硫處理變得十分重要。

常用的多糖脫硫方法, 目前主要有二甲基亞砜-甲醇法(下稱DMSO法)[6-7]、三甲基氯硅烷法(下稱CTMS法)[8]以及苯并四甲酸-Sb2O3法(下稱PMA法)[9]。其中DMSO法操作簡(jiǎn)單, 但脫硫酸基效率不高; CTMS法是一種非選擇性的脫硫方法, 由于所用試劑容易爆炸, 實(shí)驗(yàn)具有一定危險(xiǎn)性; PMA法操作雖較復(fù)雜, 但用時(shí)短、安全性好。雖然國(guó)外學(xué)者對(duì)上述方法分別進(jìn)行了脫硫效果研究, 但缺乏對(duì)它們?cè)谕粯悠返牡寐?、脫硫率以及脫硫前后分子質(zhì)量變化的綜合評(píng)價(jià)。

卡拉膠(carrageenan)是某些紅藻中廣泛存在的硫酸多糖。根據(jù)其單糖種類以及硫酸酯基取代位置的不同, 卡拉膠有十幾種(如α、β、κ、ι、λ、ν、π、θ、ω、ζ、γ等), 其中κ-卡拉膠在食品中應(yīng)用最多, 它是由(1→3)-4-硫酸-β-D-半乳糖和(1→4)-3,6-內(nèi)醚-α-D-半乳糖交替連接而成, 因其具有顯著的免疫調(diào)節(jié)[10]和抗病毒[11]活性而受到廣泛關(guān)注。作為硫酸半乳聚糖的κ-卡拉膠, 分子中不僅含有酸不穩(wěn)定的3,6-內(nèi)醚半乳糖, 且其硫酸酯基處于難脫除的半乳糖 C4位, 是研究脫硫方法的良好原料。本文以κ-卡拉膠為研究對(duì)象, 首次比較了三種脫硫方法的優(yōu)缺點(diǎn), 并利用建立的方法評(píng)價(jià)了其他海洋來源硫酸多糖的脫硫效果, 為各種硫酸多糖的脫硫, 尤其是硫酸多糖的結(jié)構(gòu)分析提供了有用參考。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

材料:κ-卡拉膠(K. Striatium), 煙臺(tái)市潤(rùn)隆海洋生物制品有限公司, 精制后使用;λ-卡拉膠、ι-卡拉膠,sigma公司。巖藻聚糖硫酸酯, 實(shí)驗(yàn)室自制。

試劑: 苯并四甲酸(pyromellitic acid, PMA),sigma公司; 三甲基氯硅烷(chlorotrimethylsilane,CTMS), Acros organics公司; 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器: Shodex OHpak SB-806M HQ凝膠色譜柱(8.0 mm ID×300 mm, 13μm), 日本昭和電工; 732#陽(yáng)離子交換樹脂小柱(18mm ID×50mm), 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 紅外光譜儀(Nicolet Nexus 470型),Thermo Electron公司; 高效液相色譜儀(Agilent 1260,配柱溫箱, 自動(dòng)進(jìn)樣器, 示差檢測(cè)器), 美國(guó)安捷倫公司; 紫外可見分光光度計(jì)(UV-2102 PCS), 尤尼柯上海公司; 十八角度激光散射儀(DAWN HELEOSTMⅡ Light Scattering Instrument), 美國(guó)Wyatt Technology 公司; 透析袋(MWCO 3.5kD),Spectrum Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1κ-卡拉膠吡啶鹽制備[8]

將精制后的50 mgκ-卡拉膠樣品溶于5 mL去離子水中, 過732#陽(yáng)離子交換樹脂小柱, 用10 mL去離子水洗脫, 收集水洗組分。用吡啶調(diào)節(jié) pH至 9, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 ～ 2 mL, 冷凍干燥, 得到κ-卡拉膠吡啶鹽(κPy)。

1.2.2 DMSO脫硫法[6-7]

將 60 mgκPy(約 50 mgκ-卡拉膠)加到 10 mL 干燥具塞玻璃瓶中, 加入4.5 mL無水DMSO和0.5 mL無水甲醇, 超聲溶解后, 于 80 ℃沙浴反應(yīng) 10 h后,冷卻至室溫, 加入5 mL蒸餾水終止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析去除有機(jī)溶劑、鹽等雜質(zhì), 內(nèi)液離心后過0.22 μm膜, 旋蒸、凍干。

1.2.3 CTMS法[8]

取 60 mgκPy(約 50 mgκ-卡拉膠), 加到 10 mL干燥具塞玻璃瓶中, 用5 mL無水吡啶溶解后, 加入CTMS 0.67 mL, N2保護(hù)下100 ℃油浴反應(yīng)8 h后, 緩慢加入5 mL蒸餾水終止反應(yīng)。其他步驟同上。

1.2.4 PMA法[9]

取 60 mg κPy(約 50 mgκ-卡拉膠), 加到 100 mL干燥圓底燒瓶中, 加入9 mL 無水DMSO和1 mL無水吡啶, 磁力攪拌溶解后, 分別加入65 mg PMA和60 mg Sb2O3, 再加入1 mL吡啶, 在N2保護(hù)下, 在120 ℃磁力攪拌油浴中攪拌反應(yīng)3 h后, 冷卻至室溫,向反應(yīng)體系中加入 3 %碳酸氫鈉水溶液 5mL, 終止反應(yīng)。其他處理步驟同上。

1.2.5 硫酸基含量分析[12]

采用硫酸鋇比濁法測(cè)定。

“數(shù)學(xué)教育中的歷史與認(rèn)識(shí)論歐洲暑期大學(xué)”中的“認(rèn)識(shí)論”主要是指（2）中的“歷史認(rèn)識(shí)論”，尤其強(qiáng)調(diào)數(shù)學(xué)知識(shí)建構(gòu)中的問題、錯(cuò)誤、猜想及“認(rèn)識(shí)論斷裂”這個(gè)概念的作用．

1.2.6 紅外光譜分析

取各多糖樣品以及脫硫后樣品適量, 用 P2O5干燥48 h, 取1 ～ 2 mg經(jīng)KBr壓片后進(jìn)行紅外光譜分析, 掃描范圍為 400 ～ 4 000 cm-1。

1.2.7 分子質(zhì)量測(cè)定

將樣品用0.1 mol/L Na2SO4配成5 g/L溶液, 經(jīng)Shodex OHpak SB-806 HQ色譜柱分離, 采用示差和十八角激光散射儀聯(lián)用技術(shù)分析測(cè)定各樣品分子量。進(jìn)樣量100 μL, 柱溫35 ℃, 流速0.5 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品得率和硫酸基含量

樣品經(jīng)三種方法脫硫后, 分別凍干、稱重, 計(jì)算產(chǎn)率, 結(jié)果如表1所示。由表1可知, PMA法(62.0 %)及 CTMS法(50.6 %)產(chǎn)率相對(duì)較高, 而 DMSO 法(45.3 %)產(chǎn)率較低。產(chǎn)率的高低主要與以下因素有關(guān),一是原料起始為鈉型, 使用陽(yáng)離子交換樹脂將其轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫? 與吡啶反應(yīng)生成吡啶鹽, 以增加其溶解度, 然后脫除硫酸基, 最終原料二糖單位分子質(zhì)量降低(圖 1), 導(dǎo)致產(chǎn)率降低; 另一個(gè)原因是由于脫硫過程中造成了多糖的降解, 形成降解產(chǎn)物, 在后續(xù)透析過程中造成損失, 從而降低得率。

本實(shí)驗(yàn)κ-卡拉膠鈉鹽二糖重復(fù)單元的分子質(zhì)量為 408.3 D, 當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)檫拎}后, 二糖單元分子質(zhì)量變?yōu)?464.4 D。如果κ-卡拉膠全部脫硫, 則得到β-卡拉膠, 其二糖重復(fù)單元的分子質(zhì)量為306.3 D。由κ-卡拉膠變?yōu)棣?卡拉膠的理論得率為 75.0 %(306.3/408.3)(圖1)。由于三種方法脫硫所用的溫度、試劑等均不同, 產(chǎn)物顏色也不同, 如 DMSO法產(chǎn)物為白色, 其余兩個(gè)產(chǎn)物均為淺褐色, 但所用產(chǎn)物均為無定型粉末。

從表1可看出, 不同方法脫硫效果不同, CTMS法及DMSO法對(duì)于κ-卡拉膠脫硫效果不如PMA法, PMA法的脫硫率為82.8 %, 是一種較理想的脫硫方法。

圖1 脫硫前后卡拉膠二糖重復(fù)單元結(jié)構(gòu)Fig. 1 Repeating disaccharide structure of κ-carrageenan before and after desulfation

表1 κ-卡拉膠脫硫前后得率、硫酸基含量及分子質(zhì)量分析Tab. 1 The yield, sulfate content and molecular mass analysis of κ-carrageenan before and after desulfation

2.2 樣品分子質(zhì)量分析

脫硫反應(yīng)均會(huì)造成多糖不同程度的降解, 其降解程度與樣品結(jié)構(gòu)、反應(yīng)體系溫度、含水量及溶劑種類等因素有關(guān)。本文將樣品轉(zhuǎn)化為吡啶鹽, 有利于提高樣品在體系中的溶解度。κ-卡拉膠在采用 PMA法、CTMS法和DMSO法脫硫后, 峰型不同, 出峰時(shí)間延長(zhǎng), 表明分子質(zhì)量均降低，結(jié)果見圖2和表1。

示差和十八角激光散射儀聯(lián)用技術(shù)是一種不需標(biāo)準(zhǔn)品, 可以直接測(cè)定樣品分子質(zhì)量的分析技術(shù),示差信號(hào)顯示樣品組成, 激光信號(hào)測(cè)定分子質(zhì)量。選取激光信號(hào)與示差信號(hào)重合部分進(jìn)行計(jì)算, 獲得樣品分子質(zhì)量數(shù)據(jù)。從表1可知, 產(chǎn)物的峰位分子質(zhì)量由83.1 kD分別降為4.75 、22.3 和15.7 kD, 與脫硫前相比, 分子質(zhì)量均明顯降低。DMSO法得率較低,是由于產(chǎn)生大量寡糖(dp 4-20), 在透析過程中損失所致, 這一點(diǎn)經(jīng)Toshi[13]研究組用DMSO法制備脫硫的硫酸軟骨素寡糖證實(shí); 而PMA法雖然產(chǎn)物分子質(zhì)量降低, 但不會(huì)降解產(chǎn)生寡糖[9], 因此在透析過程中損失較少, 產(chǎn)率相對(duì)較高。

圖2 不同脫硫方法多糖樣品HPGPC-RI-MALLS圖譜Fig. 2 HPGPC-RI-MALLS chromatographs of polysaccharides before and after desulfation by different methods

2.3 紅外光譜分析

從分子質(zhì)量分析可知, 多糖脫硫前后發(fā)生不同程度降解, 降解后多糖骨架是否破壞是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。脫硫前后κ-卡拉膠的紅外光譜分析如圖 3所示。1 250 cm-1左右為硫酸酯基中S=O伸縮振動(dòng)峰,其強(qiáng)弱可以初步判定硫酸基的多少, 通過比較其與1069 cm-1處C-O伸縮振動(dòng)峰(表征糖總量), 可以考察脫硫效果。κ-卡拉膠中C4位硫酸基的紅外特征吸收峰在 845 cm-1處, 比較此處吸收, 可表征硫酸基脫除效果; 930 cm-1為3,6內(nèi)醚特征吸收峰。

由圖3可知, DMSO法脫硫產(chǎn)物在1 250 cm-1處吸收峰峰值仍很高, 脫硫效果不理想; CTMS法與DMSO法比較, 1 250 cm-1處峰值有所降低, 但總體仍較高, 而且 850 cm-1(C4位硫酸基)有較明顯吸收峰,說明脫硫效果不理想; PMA法在1 250 cm-1吸收峰小, 850 cm-1沒有明顯吸收峰, 說明脫硫效果顯著,且脫硫后多糖特征吸收沒有明顯改變, 說明沒有破壞κ-卡拉膠主鏈結(jié)構(gòu)。

圖3 κ-卡拉膠及脫硫樣品的FTIR圖譜Fig. 3 FTIR spectra of κ-car and different samples of desulfation

2.4 PMA法在其他硫酸多糖脫硫中應(yīng)用

為了驗(yàn)證PMA法的有效性, 本文進(jìn)一步對(duì)其他硫酸多糖進(jìn)行脫硫分析。

選擇λ-卡拉膠、ι-卡拉膠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 應(yīng)用PMA法進(jìn)行脫硫, 產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜分析, 其結(jié)果如圖 4和圖5。

圖4 λ-卡拉膠脫硫前后樣品FTIR圖譜Fig. 4 FTIR analysis of λ-carrageenan before and after desulfation

圖5 ι-卡拉膠脫硫前后樣品紅外光譜分析Fig. 5 FTIR analysis of ι-carrageenan before and after desulfation

由圖4和圖5 可知, 脫硫產(chǎn)物在1 250cm-1處吸收峰明顯降低, 而且λ-卡拉膠在830 cm-1、806 cm-1(C2位硫酸基吸收)及820 cm-1(C6位硫酸基吸收)處吸收峰降低,ι-卡拉膠在 806 cm-1(C2位硫酸基吸收)、845 cm-1(C4位硫酸基吸收)處吸收峰降低, 說明PMA法對(duì)C2、C4、C6位硫酸基均有較好的脫除效果。

海蒿子(Sargassum pallidum)水提取物用強(qiáng)陰離子交換色譜(Q Sepharose FF, 1 mol/L NaCl)分離獲得一種巖藻聚糖硫酸酯, 用 PMA 法脫硫, 將脫硫前(A)與脫硫后(B)樣品進(jìn)行了紅外光譜分析, 其結(jié)果如圖6所示。脫硫前該組分在1 250 cm-1處峰值很高, 脫硫產(chǎn)物(B)在 1 250 cm-1處吸收峰幾乎消失, 說明PMA法對(duì)此多糖的脫硫效果較理想, 其硫酸基含量由脫硫前的20 %降低到4 %左右。

圖6 海蒿子巖藻聚糖硫酸酯脫硫前(A)和脫硫后(B)紅外光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of polysaccharides from Sargassum Pallidum after (A) and before (B)desulfation

3 結(jié)論

本文以κ-卡拉膠為研究對(duì)象, 考察了PMA法、CTMS法、DMSO法對(duì)其脫硫的效果, 從產(chǎn)率、硫酸基含量、紅外光譜、分子量等方面考察, 表明 PMA法是一種較理想的多糖脫硫方法, 該法脫硫效率高,用時(shí)短, 優(yōu)于CTMS法、DMSO法。利用PMA法對(duì)其他海洋硫酸多糖樣品進(jìn)行脫硫?qū)嶒?yàn), 同樣得到了較理想的效果。本方法為從事糖類構(gòu)效關(guān)系研究, 以及海洋糖類藥物開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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