劉 旭, 曲桂燕, 周裔彬, 袁 毅, 韓麗君

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 安徽 合肥 230036; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國(guó)海洋大學(xué),山東 青島 266100)

巖藻聚糖硫酸酯是存在于褐藻中的一種水溶性雜多糖, 其主要成分除了 L-巖藻糖和硫酸根外, 還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)[1-2]等。研究表明, 巖藻聚糖硫酸酯具有廣泛的生理活性, 如具有抗氧化[3]、抗凝血[3-4]、抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、降血脂[7]、抗癌[8-9]、調(diào)節(jié)免疫[10]等作用, 具有廣闊的保健品、藥品開發(fā)前景。

海帶廢渣是工業(yè)上用海帶提取碘、甘露醇、褐藻酸鈉后剩余的殘?jiān)? 研究其成分發(fā)現(xiàn),其中含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相當(dāng)于原海帶干重的 70%左右[11], 除了含有粗纖維素、蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)和微量元素等, 還含有相當(dāng)含量?jī)r(jià)值極高的巖藻聚糖硫酸酯。但大量的海帶廢渣因成分復(fù)雜, 且廣泛存在于生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢水中, 難以處置和開發(fā), 故隨著生產(chǎn)的完成作為廢棄物排放, 不僅浪費(fèi)其大量的有效成分,還帶來(lái)一系列環(huán)境污染問(wèn)題。

目前提取巖藻聚糖硫酸酯的原料大多為新鮮海帶[1,12-13], 但以海帶廢渣為原料提取巖藻聚糖硫酸酯還未見報(bào)道。海帶廢渣雜質(zhì)較多, 含較多褐藻膠,褐藻膠遇水膨脹, 使海帶廢渣在水溶液中吸水膨脹,從而吸附大量提取溶劑。此外, 大量褐藻膠的存在也給后期巖藻聚糖硫酸酯的純化帶來(lái)困難, 使提取更加復(fù)雜和不易實(shí)施, 影響巖藻聚糖硫酸酯實(shí)際提取率。CaCl2可與褐藻膠生成不易膨脹的褐藻酸鈣, 從而抑制海帶膨脹[14]。本文采用氯化鈣水提法從海帶廢渣中提取巖藻聚糖硫酸酯, 并采用響應(yīng)面分析法(response surface methodology, RSM)[15-21], 利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì), 采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系, 通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最佳提取參數(shù), 并以響應(yīng)面分析對(duì)提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化, 解決了提取參數(shù)多變量的問(wèn)題, 獲得了最佳提取參數(shù)以及較高的提取率。

1 材料、儀器與試劑

海帶廢渣(采自日照結(jié)晶集團(tuán)), 清洗去除表面雜質(zhì), 50℃烘箱中干燥至恒重后粉碎, 過(guò) 100目篩備用。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司); 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-4(國(guó)華電器有限公司)萬(wàn)能粉碎機(jī); Unico UV-2000分光光度計(jì)(尤尼科(上海)儀器有限公司); SC-3610低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司); RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); 冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

95%乙醇; K2SO4、BaCl2、明膠、濃鹽酸; L-半胱氨酸鹽酸鹽、濃硫酸以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。L-巖藻糖(Sigma)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 提取工藝

稱取 5 g海帶廢渣粉, 以不同料液比(g/mL)(1%CaCl2)加入水混勻, 在不同條件下提取多糖。操作完畢后離心, 取上清液抽濾, 濾液減壓濃縮, 后加入95%乙醇至其終體積分?jǐn)?shù)為30%, 靜置1 h, 離心去褐藻膠, 上清液加入 95%乙醇至其終體積分?jǐn)?shù)為70%, 離心收集巖藻多糖粗沉淀。用無(wú)水乙醇洗滌沉淀, 冷凍干燥得粗品。稱重并計(jì)算得率。

2.2 單因素試驗(yàn)

選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比這三個(gè)對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率有顯著影響的因素, 以提取率為考察指標(biāo), 得出較佳的單因素水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。參考以往文獻(xiàn), 設(shè)提取溫度 6個(gè)水平, 分別為40, 50, 60, 70, 80, 90℃。其他試驗(yàn)條件一致:V用水體積/W干粉重量=40, 提取時(shí)間4 h; 提取時(shí)間6個(gè)水平, 分別為 2, 3, 4, 5, 6, 7 h。其他試驗(yàn)條件一致:V用水體積/W干粉重量=40, 溫度為 70℃; 料液比 6個(gè)水平, 分別為1∶30, 1∶40, 1∶50, 1∶60, 1∶70, 1∶80。其他試驗(yàn)條件一致: 提取時(shí)間4 h, 溫度為70℃。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù) Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理, 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果, 選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比3因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn), 采用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行回歸分析。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab. 1 Factors and Levels of response surface analysis

2.4 分析方法

2.4.1 巖藻糖含量測(cè)定(半胱氨酸鹽酸鹽法[22]):

以 L-巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0019x+0.0015,R2=0.9985。

樣品含量測(cè)定: 取配制的0.1%樣品溶液0.2 mL,按標(biāo)準(zhǔn)糖的方法測(cè)定其吸光度, 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其巖藻糖含量。

2.4.2 硫酸根含量測(cè)定——明膠氯化鋇比濁法[23]

以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=2.6728x+0.0075,R2=0.9962。

樣品含量測(cè)定: 取一定量樣品放入安瓿瓶中,加2 mol/LHCl 8 mL, 待樣品溶脹后, 封管, 在水浴鍋中加熱4 h, 取出冷至室溫。把樣品從安瓿瓶中取出, 用蒸餾水慢慢少量沖洗, 定容至25 mL。濾紙過(guò)濾, 取1 mL按標(biāo)準(zhǔn)品方法測(cè)其吸光度, 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其巖藻糖含量。

2.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert8.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析, 每組試驗(yàn)重復(fù) 3次, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溫度對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

固定料液比 1∶40, 分別在提取溫度為 40～90℃下提取4 h, 提取溫度對(duì)提取率的影響見圖1。

圖1 溫度對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig. 1 The effect of extraction temperature on fucoidan yield

由圖 1可知, 當(dāng)溫度由 40～70℃時(shí), 巖藻聚糖硫酸酯提取率迅速上升, 最高達(dá)到 2.3%; 但當(dāng)溫度繼續(xù)升高, 在70～90℃時(shí), 得率反而下降?？赡茈S著溫度的升高, 巖藻聚糖硫酸酯發(fā)生降解, 導(dǎo)致得率有所下降。

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

固定提取溫度為70℃, 料液比1∶40, 分別提取2～7 h, 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖2。

由圖2可知, 當(dāng)提取時(shí)間由2 h延長(zhǎng)至5 h, 巖藻聚糖硫酸酯提取率不斷升高, 最高達(dá)到2.37%; 但當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至7 h時(shí), 提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致多糖部分降解。

圖2 時(shí)間對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig. 2 The effect of extraction time on fucoidan yield

3.1.3 料液比對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響

固定提取溫度為70℃, 提取時(shí)間為4 h, 料液比分別為 1∶30～1∶80, 料液比對(duì)提取率的影響見圖3。

由圖3可知, 隨著料液比的增加, 巖藻聚糖硫酸酯的提取率不斷升高, 當(dāng)料液比為1∶80時(shí), 提取率達(dá)到最高3.41%, 但當(dāng)料液比從1∶70增長(zhǎng)到1∶80時(shí), 提取率上升趨于平緩?？紤]生產(chǎn)成本, 料液比不宜再增加。

圖3 料液比對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的影響Fig. 3 The effect of material/liquid ratio on fucoidan yield

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化巖藻聚糖硫酸酯提取工藝條件

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù) Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理, 設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn), 其中 12個(gè)分析點(diǎn), 5個(gè)為零點(diǎn)以評(píng)估試驗(yàn)誤差。巖藻聚糖硫酸酯得率為響應(yīng)值。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

利用Design-Expert8.0統(tǒng)計(jì)軟件, 對(duì)表2中提取率試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合, 獲得巖藻聚糖硫酸酯提取率對(duì)編碼自變量提取溫度、提取時(shí)間和料液比的二次多項(xiàng)回歸方程。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立的數(shù)學(xué)模型為:Y=3.40+0.23A+0.15B+0.34C-0.15AB-0.16AC+0.035BC-0.18A2-0.010B2+9.500E-003C2。

3.2.2 回歸模型方差分析

利用Design-Expert8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析, 結(jié)果如表3所示。

由表3可知, 模型具有高度顯著性。失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率, 表 3中失擬項(xiàng)不顯著, 表明模型選擇合適。同時(shí), 軟件分析得到模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9570, 相關(guān)度較好。變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度, CV 值越低, 模型的置信度越高, 本試驗(yàn)的 CV為 3.35%, 表明此模型擬合度和可信度均較高, 方差分析表明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性, 因此能用此模型對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從表3還可以看出, 對(duì)提取率影響的大小依次為料液比(C)、溫度(A)、時(shí)間(B)。溫度和時(shí)間(AB)、溫度和料液比(AC)交互作用顯著。

表3 回歸模型的方差分析Tab. 3 Variance analysis of the regression model

3.2.3 響應(yīng)曲面分析

RSM 方法的圖形是特定的響應(yīng)面(Y)與對(duì)應(yīng)的因素構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖,每個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析, 另外兩個(gè)因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響, 從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們?cè)谔崛∵^(guò)程中的相互作用將建立的回歸模型中的任意兩個(gè)因素固定在零水平, 得到另外兩因素的交互影響, 二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖,見圖4。

圖4直觀地反映了各因素及交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響, 比較圖4中6個(gè)圖可以看出: 提取溫度、提取時(shí)間和料液比與巖藻聚糖硫酸酯得率存在顯著的相關(guān)性。提取溫度與提取時(shí)間(AB), 提取溫度與料液比(AC)對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的交互效應(yīng)較顯著,表現(xiàn)為曲線較陡; 而提取溫度與料液比(BC)對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率的交互作用不顯著, 表現(xiàn)為曲線較平滑。

3.2.4 巖藻聚糖硫酸酯最佳提取條件的確定與驗(yàn)證試驗(yàn)

在選取的各因素范圍內(nèi), 根據(jù)回歸模型通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析得出巖藻聚糖硫酸酯最佳提取條件為: 提取溫度68℃, 提取時(shí)間6 h, 料液比1∶80。在此條件下軟件基于回歸模型預(yù)測(cè)提取率為3.83%。

按照優(yōu)化試驗(yàn)方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn), 重復(fù)3次, 取平均值, 實(shí)測(cè)巖藻聚糖硫酸酯得率為(3.95±0.065)%,與軟件預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為 0.0304, 說(shuō)明所選模型合適, 優(yōu)選的提取工藝適合巖藻聚糖硫酸酯的提取。巖藻聚糖硫酸酯粗品中巖藻糖含量為(17.47±0.022)%,硫酸根含量為(37.14±0.025)%。

4 結(jié)論

圖4 各因素交互作用對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactions of the extraction conditions

試驗(yàn)以海帶廢渣為原料, 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 利用響應(yīng)面建立了二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型回歸方程:Y=3.40+0.23A+0.15.15B+0.34C-0.15AB-0.16AC+0.035BC-0.18A2-0.010B2+9.5×10-3C2。該方程擬合度較高, 能較好地預(yù)測(cè)巖藻聚糖硫酸酯提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律?；貧w模型方差分析得到溫度、時(shí)間、料液比對(duì)提取率有極顯著影響, 并且溫度和時(shí)間、溫度和料液比的交互作用影響很大。利用響應(yīng)面曲面及其等高線分析方法對(duì)巖藻聚糖硫酸酯提取工藝進(jìn)行優(yōu)化, 得到優(yōu)化工藝參數(shù): 提取溫度 68℃,提取時(shí)間6 h, 料液比1∶80。模型預(yù)測(cè)優(yōu)化工藝獲取巖藻聚糖硫酸酯提取率的預(yù)測(cè)值 3.83%, 通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證, 實(shí)際提取率為3.95%。粗品中巖藻糖含量為17.47%, 硫酸根含量為 37.14%。因此本文從海帶廢渣中提取巖藻聚糖硫酸酯, 與以往從海帶或其他藻類中提取相比較[2,4,9,24], 成本低廉, 且對(duì)海帶廢渣的利用具有一定意義。

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