徐 杏, 于仁成, 羅 璇, 馮振洲, 李愛峰, 顏 天, 周名江, 白 潔

(1. 中國海洋大學(xué) 教育部海洋環(huán)境與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266100; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島266071)

目前, 有害赤潮已經(jīng)成為全球性的海洋環(huán)境問題, 對人類健康、自然生態(tài)和海水養(yǎng)殖構(gòu)成了巨大威脅[1-2]。其中, 有毒藻形成的有害赤潮尤其令人關(guān)注。有毒赤潮藻能夠產(chǎn)生藻毒素, 在貝類和魚類體內(nèi)累積, 并沿食物鏈傳遞, 危害高營養(yǎng)級的海洋生物, 甚至危及人類健康。常見的藻毒素包括麻痹性貝毒(Paralytic Shellfish Poison), PSP)、腹瀉性貝毒(Diarrhetic Shellfish Poison, DSP)、神經(jīng)性貝毒(Neurotoxic Shellfish Poison, NSP)、記憶缺失性貝毒(Amnesic Shellfish Poison, ASP)和西加魚毒素(Ciguatera Fish Poison, CFP)等[3]。其中, DSP 毒素是近年來受到密切關(guān)注的一類藻毒素[4-5]。

在以往研究中, 通常將 DSP毒素分為三類: 即酸性毒素大田軟海綿酸(Okadaic acid, OA)及其衍生物鰭藻毒素(Dinophysistoxins, DTXs), 聚醚內(nèi)酯類毒素(Pectenotoxins, PTXs)和帶有硫酸基團(tuán)的聚醚類毒素(Yessotoxins, YTXs)。但是, 后兩類毒素實(shí)際上不會導(dǎo)致腹瀉癥狀[6], 而 OA和DTX毒素能夠抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A, 從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的超磷酸化, 不僅會使中毒患者出現(xiàn)腹瀉等癥狀, 而且會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 具有促進(jìn)腫瘤形成的長期毒性效應(yīng)[7]。因此, OA和DTX等DSP毒素是水產(chǎn)品質(zhì)量控制中需要密切關(guān)注的一類毒素, 迫切需要開展全面的檢測和分析工作。但是, DSP標(biāo)準(zhǔn)毒素價格昂貴, 這在很大程度上制約著對 DSP毒素檢測和分析工作的開展。

根據(jù)以往文獻(xiàn)報道, 鰭藻屬(Dinophysis)和原甲藻屬(Prorocentrum)中的一些藻種能夠產(chǎn)生 DSP毒素,如Dinophysis fortii,D. acuminata,D. acuta,D.norvegica,D. mitra,D. rotundata,D. tripos,D. caudata, D. hastate, D. sacculus和Prorocentrum lima、P.concavum、P. redfieldi等[4,8-9]。但鰭藻屬中藻種的培養(yǎng)非常困難[4,10-11], 近年來雖然有所突破[12], 但要依靠現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)對鰭藻的大量連續(xù)培養(yǎng)仍然存在問題。因此, 從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的利瑪原甲藻中分離純化DSP毒素是獲取DSP毒素的重要來源[13]。

在我國, DSP毒素污染問題比較突出。對我國沿海貝類中毒素污染情況進(jìn)行的調(diào)查顯示, 遼東灣、膠州灣、萊州灣、秦皇島、福建等地沿海的貝類均有受到DSP毒素污染的報道[2,4,14-16]。1998年9～10月,渤海灣曾發(fā)生大面積赤潮, 其原因種之一就是能夠產(chǎn)生 DSP毒素的倒卵形鰭藻[17]?？梢? 在我國開展DSP毒素的研究非常重要。本文針對一株利瑪原甲藻(Prorocentrum limaDodge), 分析其毒素產(chǎn)生情況,并通過設(shè)計多因子實(shí)驗(yàn)探討了溫度、鹽度和光照強(qiáng)度等環(huán)境因子對利瑪原甲藻生長的影響, 以期獲得這株利瑪原甲藻的最適培養(yǎng)條件, 為開展 DSP研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種

利瑪原甲藻購自美國 Bigelow海洋科學(xué)實(shí)驗(yàn)室海洋浮游植物培養(yǎng)中心 (Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton, CCMP),藻株編號CCMP1966。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)利瑪原甲藻所用的海水取自中國科學(xué)院海洋研究所水族樓, 是經(jīng)沙濾處理后的青島匯泉灣天然海水, 鹽度為31, pH為7.9±0.1, 海水以0.45 μm混合纖維濾膜過濾后, 煮沸滅菌, 并轉(zhuǎn)至高壓滅菌的錐形瓶內(nèi), 添加 f/2-Si培養(yǎng)液后, 接入利瑪原甲藻,在 20 °C, 4 800 lx下培養(yǎng), 光暗比為 12 h∶12 h。

1.3 毒性測試與毒素分析

利瑪原甲藻毒性的測試采用小鼠腹腔注射法,用于毒性測試的昆明系小白鼠(體重為20 g±1 g)購自青島藥物研究所。取穩(wěn)定期的利瑪原甲藻培養(yǎng)液300 mL, 濾至玻璃纖維濾膜上, 用剪刀剪碎后, 加入甲醇/丙酮提取液(體積比40∶60, 含0.3%乙酸)4 mL,振蕩4 min后, 靜置提取過夜。提取液以8 000 r/min離心8 min, 取出上清液至10 mL容量瓶中, 重復(fù)提取一次, 合并上清液, 定容至 10 mL, 置于-20°C保存。分別取0.9, 3, 5.1 mL藻毒素提取液, 氮?dú)獯蹈珊? 加入3 mL 1% 吐溫-60試劑溶解后, 分別取1 mL腹腔注射3只小白鼠。對照組直接注射1%吐溫-60試劑。觀察其存活狀況24 h。

采用液-質(zhì)聯(lián)用方法對利瑪原甲藻產(chǎn)生的毒素進(jìn)行分析。將培養(yǎng)的利瑪原甲藻藻液200 mL過濾到玻璃纖維濾膜上, 剪碎, 置于 7 mL離心管中, 加入3mL酸化甲醇水提取液(甲醇: 0.05 mol/L乙酸= 9∶1), 振蕩1 min后, 置于超聲水浴中超聲處理10 min,于4℃下靜置提取過夜, 提取液8 000 r/min 離心10 min后, 取上清液以0.22 μm濾膜過濾, 濾液用于分析 DSP毒素成分。毒素分析采用美國熱電公司(ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)制造的LC-MS系統(tǒng), 其中 HPLC系統(tǒng)配備低壓混合四元泵和自動進(jìn)樣器, 質(zhì)譜檢測器為Finnigan LCQTMDeca XP Plus離子阱檢測器, 配備ESI離子化源。通過OA標(biāo)準(zhǔn)毒素的流動注射分析, 優(yōu)化質(zhì)譜檢測器參數(shù)為: 毛細(xì)管溫度275°C, 離子噴射電壓3.0 kV, 鞘氣流35 arb,毛細(xì)管電壓23 V, 入口透鏡電壓為-74 V, 透鏡電壓為-18 V, 電子管透鏡補(bǔ)償為25 V, 多孔補(bǔ)償電壓1為-4.5 V, 多孔補(bǔ)償電壓2為-9.5 V, 多孔射頻振幅為 400 Vp-p。采用選擇離子檢測(selective ion monitoring, SIM)方式, 在陽離子檢測模式下檢測OA和DTX1, 每一毒素分別檢測三種陽離子, 質(zhì)荷比分別為[OA+H]+: 805.0; [OA+NH4]+: 822.0; [OA+Na]+:827.0; [DTX1+H]+: 819.0; [DTX1+NH4]+: 836.0;[DTX1+Na]+: 841.0。用于分離OA和DTX毒素的色譜柱為PhenomenexLuna C18柱(150×2.0 mm, 3 μm,100 ?), 配備C18保護(hù)柱套(PhenomenexATO-4287,4×3 mm)。采用兩相洗脫液, 洗脫液A為水溶液, 含有2 mmol/L甲酸和 50 mmol/L甲酸銨, 洗脫液B為95%乙腈溶液, 含有2 mmol/L甲酸和 50 mmol/L甲酸銨。用30%洗脫液A 和70%洗脫液B等梯度洗脫,流速 150 μL/min。樣品注射量 10 μL。用于對比的OA和DTX1標(biāo)準(zhǔn)毒素分別購自加拿大國家科學(xué)院海洋生物學(xué)研究所和日本。

1.4 多因子影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計

實(shí)驗(yàn)于中國科學(xué)院海洋研究所水族樓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇溫度、鹽度和光照三種環(huán)境因子, 根據(jù)這株利瑪原甲藻分離地環(huán)境條件及實(shí)驗(yàn)室條件, 對三種因子分別選取三個水平, 其中溫度為18、21和24°C,鹽度為28、32和36, 光照強(qiáng)度為2 500、5 000和7 500 lx, 進(jìn)行多因子影響實(shí)驗(yàn), 總計27個處理組, 每組設(shè)置三個重復(fù)。實(shí)驗(yàn)在人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行, 容器為100 mL玻璃錐形瓶, 事先經(jīng)高壓滅菌消毒。實(shí)驗(yàn)中所用的不同鹽度海水是通過以蒸餾水稀釋天然海水、或向天然海水中補(bǔ)加氯化鈉獲得。接種用的利瑪原甲藻為處于對數(shù)生長期中期的藻, 其中, 用于接種不同鹽度實(shí)驗(yàn)組的藻預(yù)先在各實(shí)驗(yàn)鹽度下進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)后再用于接種。

對各處理組中的利瑪原甲藻進(jìn)行觀察, 并從培養(yǎng)當(dāng)天(0天)開始取樣計數(shù), 此后每隔2天取樣一次,樣品以魯格試液(Lugol’s solution)固定后, 在顯微鏡下用浮游植物計數(shù)框計數(shù), 記錄細(xì)胞密度, 并計算細(xì)胞比增長率μ:

其中:Bt1和Bt2分別是培養(yǎng)t1和t2天后的細(xì)胞密度,t1和t2為培養(yǎng)天數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

應(yīng)用多因素方差分析方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,通過F檢驗(yàn)分析各環(huán)境因子不同處理水平對利瑪原甲藻生長影響的顯著性, 按概率(P＜0.05)設(shè)置顯著性檢驗(yàn)閾值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 利瑪原甲藻的DSP毒性與毒素成分分析

通過小鼠生物測試法對培養(yǎng)利瑪原甲藻的 DSP毒性進(jìn)行了測試。結(jié)果如表1所示, 注射利瑪原甲藻提取液的實(shí)驗(yàn)組都有小鼠死亡現(xiàn)象出現(xiàn), 而且, 隨著毒素提取液注射量的增加, 死亡小鼠比例增加。實(shí)驗(yàn)中對照組小鼠未死亡?？梢钥闯? 培養(yǎng)的利瑪原甲藻具有DSP毒性, 可能產(chǎn)生DSP毒素。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 實(shí)驗(yàn)組2(注射1.0 mL提取液)毒性最接近1個鼠單位, 以此計算, 每100 mL 培養(yǎng)液中利瑪原甲藻的毒性應(yīng)在 3.3 MU(mouse unit, 鼠單位)左右。

應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用分析方法, 通過與OA和DTX1標(biāo)準(zhǔn)毒素進(jìn)行對比, 對利瑪原甲藻提取液中的 OA和DTX1毒素進(jìn)行了分析, 得到色譜圖如圖1所示?？梢钥闯? 在利瑪原甲藻提取液中存在 OA和DTX1毒素。在針對每一毒素的三種陽離子檢測結(jié)果中, 質(zhì)荷比為827.0和 841.0的陽離子[OA+Na]+和[DTX1+Na]+信號最高, 而另外兩種陽離子的信號較弱。對比 OA和DTX1標(biāo)準(zhǔn)毒素, 計算得到每100 mL培養(yǎng)的利瑪原甲藻中, OA和DTX1的含量分別為2.8 μg和6.8 μg。

表1 利瑪原甲藻提取液DSP毒性的小鼠生物測試結(jié)果Tab. 1 Mouse bioassay results on the DSP toxicity of Prorocentrum lima extract

圖1 應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用方法對利瑪原甲藻中OA和DTX1的分析結(jié)果Fig. 1 Analysis of OA and DTX1 in the extract of Prorocentrum lima cells with liquid chromatography-mass spectrometry

2.2 溫度、鹽度和光照強(qiáng)度對利瑪原甲藻生長的影響

采用比增長率作為指標(biāo), 比較了不同水平的溫度、鹽度和光照強(qiáng)度等環(huán)境因子對利瑪原甲藻生長的影響, 結(jié)果如圖2所示。應(yīng)用多因素方差分析方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計分析(表 2), 可以看出, 在三種環(huán)境因子中, 只有不同水平的鹽度對利瑪原甲藻的生長具有顯著影響(F值為 5.45, 大于F0.05(2,54)=3.16), 對于不同水平的鹽度處理組, 鹽度為 28時利瑪原甲藻的比增長率最高, 達(dá)到 0.18, 而當(dāng)鹽度分別為32和36的時候, 平均比增長率為0.16。溫度和光照實(shí)驗(yàn)各水平對利瑪原甲藻生長的影響沒有顯著差異(F值分別為1.74和1.69, 小于F0.05(2, 54)=3.16),但低溫(18°C)和高光照(7 500 lx)下,利瑪原甲藻表現(xiàn)出了較高的比增長率, 分別達(dá)到0.18和0.17。此外,溫度和鹽度及溫度和光照強(qiáng)度之間的交互作用對利瑪原甲藻的生長也有顯著影響, 而鹽度和光照強(qiáng)度之間的交互作用沒有顯著影響, 三者之間的交互作用對利瑪原甲藻的生長也沒有顯著影響。

圖2 溫度、鹽度和光照強(qiáng)度分別對利瑪原甲藻生長的影響Fig. 2 The effects of temperature, salinity and light intensity on the growth of Prorocentrum lima

表2 溫度、鹽度和光照強(qiáng)度對利瑪原甲藻生長的多因素方差分析結(jié)果(P<0.05)Tab. 2 Multifactor analysis of variance on the effects of temperature, salinity and light intensity on the growth of Prorocentrum lima

3 討論

利瑪原甲藻是一種重要的DSP產(chǎn)毒藻。但是, 目前國內(nèi)對于利瑪原甲藻的研究開展的并不多[18-21],本實(shí)驗(yàn)初步分析了一株利瑪原甲藻的毒性情況, 并研究了溫度、鹽度和光照強(qiáng)度等環(huán)境因子對利瑪原甲藻生長的影響, 以期建立最適培養(yǎng)條件, 為利瑪原甲藻的培養(yǎng)和DSP毒素研究提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)中通過小鼠生物測試法和液-質(zhì)聯(lián)用分析方法, 確定了所培養(yǎng)的利瑪原甲藻具有腹瀉性貝毒毒性, 并檢出了OA和DTX1兩種DSP毒素成分。對于其他可能存在的 DSP毒素, 由于缺少標(biāo)準(zhǔn)毒素,在此未作分析。目前, DSP小鼠生物測試法還是一種半定量的毒性測試方法, 無法給出準(zhǔn)確的毒性測試結(jié)果。但是, 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的毒素分析和毒性測試結(jié)果計算, 每100 mL培養(yǎng)的利瑪原甲藻中所含有的OA和DTX的量, 其毒性約為2.8 MU, 與小鼠生物測試法所得到的結(jié)果大致相當(dāng), 表明OA和DTX1應(yīng)當(dāng)是利瑪原甲藻所產(chǎn)生的主要毒素成分。

由于利瑪原甲藻是一種底棲或附生性海洋甲藻,極少形成高密度藻華, 因此, 對于其生長及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系研究不多。在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)[22-23], 利瑪原甲藻的豐度表現(xiàn)出一定的區(qū)域和季節(jié)差異。Carlson和Tindall[24]在Virgin Islands的調(diào)查發(fā)現(xiàn), 利瑪原甲藻豐度的變化和溫度有正相關(guān)性。Morton等[25]對從美國佛羅里達(dá)州采集的利瑪原甲藻進(jìn)行培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)利瑪原甲藻的最適溫度是 27°C, 最適鹽度為 30, 最適光照強(qiáng)度為 10%全日光, 有關(guān)最適溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文有明顯不同。本實(shí)驗(yàn)中利瑪原甲藻(CCMP1996株)的最適溫度為 18°C, 最佳生長鹽度為28, 而光照強(qiáng)度為7 500 lx。但是, 在各因子的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi), 不同水平的溫度和光照對于利瑪原甲藻的生長并沒有顯著影響。由于本實(shí)驗(yàn)所用的利瑪原甲藻采自緬因?yàn)澈Ｓ? 水溫偏低, 因此, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能是藻株對其生長環(huán)境長期適應(yīng)的結(jié)果。

利瑪原甲藻是底棲性或附生性甲藻, 盡管在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)過程中, 有一部分藻細(xì)胞處于浮游狀態(tài), 但仍有相當(dāng)一部分藻細(xì)胞結(jié)合在一起, 呈絮狀或網(wǎng)狀附著在錐形瓶底, 給實(shí)驗(yàn)過程中的取樣和計數(shù)帶來了很大的困難。以往文獻(xiàn)曾報道有多種能夠反映藻類生長的指標(biāo), 如細(xì)胞顯微計數(shù)、葉綠素a分析、分光光度法(比濁法)、庫爾特計數(shù)法、流式細(xì)胞儀計數(shù)[26-27]等, 但這些指標(biāo)在應(yīng)用于利瑪原甲藻生物量測定時都存在一定的問題, 葉綠素 a含量測定耗時長, 不利于連續(xù)測定; 而分光光度法和其他幾種計數(shù)方法都會不同程度地受到絮狀結(jié)塊的利瑪原甲藻細(xì)胞影響, 降低測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。為盡可能準(zhǔn)確反映利瑪原甲藻生長的情況, 我們選擇了傳統(tǒng)的顯微計數(shù)方法, 同時在取樣時振搖錐形瓶, 并用原培養(yǎng)液沖洗幾次培養(yǎng)瓶, 增加對每組實(shí)驗(yàn)的計數(shù), 以盡量降低取樣和計數(shù)誤差。此外, 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn), 在藻細(xì)胞培養(yǎng)初期, 培養(yǎng)液中藻細(xì)胞密度相對較低,計數(shù)結(jié)果受誤差影響較大, 重現(xiàn)性低。進(jìn)入對數(shù)生長期后, 隨著藻細(xì)胞密度的逐漸增加, 取樣和計數(shù)誤差對計數(shù)結(jié)果的影響有所降低。因此, 為盡可能降低取樣和計數(shù)誤差的影響, 比增長率的計算都選在對數(shù)生長初期進(jìn)行, 也就是從接種后一周左右開始,計算此后10天里利瑪原甲藻的平均比增長率, 用于數(shù)據(jù)分析。

4 結(jié)論

綜上所述, 本文對一株利瑪原甲藻進(jìn)行了室內(nèi)培養(yǎng)和毒性測試, 初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這株利瑪原甲藻可以產(chǎn)生OA和DTX1等DSP毒素。通過多因子實(shí)驗(yàn)研究了溫度、鹽度和光照強(qiáng)度對利瑪原甲藻生長的影響, 結(jié)果表明不同水平的鹽度對利瑪原甲藻生長有顯著影響, 而溫度和光照強(qiáng)度的影響并不顯著。在實(shí)驗(yàn)的溫度、鹽度和光照強(qiáng)度范圍內(nèi), 利瑪原甲藻在低溫(18°C)、低鹽(28)和高光照強(qiáng)度(7500 lx)條件下生長較好。這些結(jié)果為利用利瑪原甲藻開展DSP研究提供了基礎(chǔ)資料。

[1]Zingone A, Enevoldsen H O. The diversity of harmful algal blooms: a challenge for science and management[J]. Ocean & Coastal Management, 2000, 43:725-748.

[2]周名江, 朱明遠(yuǎn), 張經(jīng). 中國赤潮的發(fā)生趨勢和研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2001, 13 (2): 54-60.

[3]齊雨藻, 周名江, 鄒景忠, 等. 中國沿海赤潮 [M].北京: 科學(xué)出版社, 2003.

[4]楊維東, 彭春喜, 劉潔生, 彭志英, 等. 腹瀉性貝毒研究現(xiàn)狀[J]. 海洋科學(xué), 2005, 29 (5): 66-72.

[5]丁君. 赤潮毒素中腹瀉性貝毒和麻痹性貝毒的研究及進(jìn)展[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報, 2001, 16 (3): 212-218.

[6]Miles C O, Wilkins A L, Munday R, et al. Isolation of pectenotoxin-2 fromDinophysis acutaand its conversion to pectenotoxin-2 seco acid, and preliminary assessment of their acute toxicities[J]. Toxicon, 2004,43:1-9.

[7]Fernández J J, Candenas M L, Souto K L, et al.Okadaic acid, useful tool for studying cellular processes.Current Med Chem, 2000, 9(2): 229-262.

[8]Viviani R. Eutrophication, marine biotoxins, human health [J]. Sci Total Environ, Suppl, 1992: 631-662.

[9]Hallegraeff G M, Anderson D M, Cembella A D. Manual on harmful marine microalgae [M]. Paris: Intergovernmental Oceanographic Commission, UNESCO,1995.

[10]Lawrence J E, Cembella A D. An immunolabeling technique for the detection of diarrhetic shellfish toxins in individual dinoflagellate cells [J]. Phycologia, 1999,38(1): 60-65.

[11]周名江, 于仁成. 有害赤潮的形成機(jī)制、危害效應(yīng)與防治對策 [J]. 自然雜志, 2007, 29 (2): 72-77.

[12]Park M G, Kim S J, Kim H S, et al. First successful culture of the marine dinoflagellateDinophysis acuminata[J]. Aquat Microb Ecol, 2006, 45: 101-106.

[13]Bravoa I, Femandez M L, Ramiloa I, et al. Toxin composition of the toxic dinoflagellateProrocentrum limaDodgeisolated from different locations along the Galician coast (NW Spain)[J].Toxicon, 2001, 39:537-1545.

[14]周名江, 李鈞. 赤潮藻毒素研究進(jìn)展[J]. 中國海洋藥物, 1999, 18(3): 48-54.

[15]李偉才, 欒剛, 李立, 等. 我國沿海部分海區(qū)貝毒毒素的調(diào)查[J]. 海洋科學(xué), 2000, 24(9): 19-22.

[16]劉寧, 潘國偉, 李春盛, 等. 遼東灣赤潮污染海區(qū)貝類軟海綿酸的染毒情況調(diào)查分析[J]. 中國公共衛(wèi)生,1999, 15 (3): 209-210.

[17]陳則玲, 付云娜, 鞏寧.腹瀉性貝毒及其高效液相色譜檢測方法[J].海洋通報, 2000, 19(1): 73-78.

[18]邱德全, 林永水, 周近明. 利瑪原甲藻腹瀉性貝毒的生物學(xué)測定[J]. 熱帶海洋, 1996, 15 (4):46-49.

[19]楊維東, 鐘娜, 劉潔生, 等. 不同磷源及濃度對利瑪原甲藻生長和產(chǎn)毒的影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2008,29(10): 2760-2765.

[20]楊維東, 李麗璇, 劉潔生, 等. 海洋底棲甲藻——利瑪原甲藻(Prorocentrum lima)對三種赤潮藻的化感作用[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2008, 28(8): 1631-1637.

[21]鐘娜, 楊維東, 劉潔生, 等. 不同氮源對利瑪原甲藻(Prorocentrum lima)生長和產(chǎn)毒的影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2008, 28 (6): 1186-1191.

[22]Jo F, Duncan A P, Steven M, et al. Epiphytic abundance and toxicity ofProrocentrum limapopulations in the Fleet Lagoon, UK [J]. Harmful Algae, 2005, 4:1063-1074.

[23]Lucie M, Susannah C, Paul E H.Prorocentrum lima(Dinophyceae)in northeastern USA coastal waters I.Abundance and distribution [J]. Harmful Algae, 2007, 6:1-9.

[24]Carlson R D , Tindall D R. Distribution and periodicity of toxic dinoflagellates in the Virgin Islands[A]//Anderson D M. Toxic Dinoflagellates.New York:Elsevier, 1985: 171-176.

[25]Steve L M, Dean R N, Jeffrey W B. Effect of temperature, salinity and light intensity on the growth and seasonality of toxic dinoflagellates associated with ciguatera [J]. J Exp Mar Biol Ecol, 1992, 157: 79-90.

[26]董正臻, 董振芳, 丁德文. 快速測定藻類生物量的方法探討[J]. 海洋科學(xué), 2004, 28(11): 1-5.

[27]侯建軍, 黃邦欽, 戴相輝. 赤潮藻細(xì)胞計數(shù)方法比較研究[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2004, 20(8): 907-908.