陳小芳，陳顯凌，鄒起練，吳勇，陳元仲

1 福建省血液病研究所 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建 福州 350001

2 福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，福建 福州 350004

生物技術(shù)與方法

纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及鑒定

陳小芳1，陳顯凌1，鄒起練2，吳勇1，陳元仲1

1 福建省血液病研究所 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建 福州 350001

2 福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，福建 福州 350004

為在畢赤酵母中表達(dá)纖維連接蛋白 C端肝素結(jié)合域 (Fibronectin C-terminal heparin-binding domain FNCHBD) 多肽并研究其功能，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增FNCHBD目的基因，將目的基因與T載體連接，經(jīng)測(cè)序正確后，插入pAo815SM酵母表達(dá)載體增加基因拷貝數(shù)，然后酶切克隆入酵母表達(dá)載pPIC9K；將重組質(zhì)粒SalI酶切線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株，篩選工程菌，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，用 SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵上清液，表明有重組蛋白FNCHBD多肽的高表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過離心、超濾、離子交換層析純化，純化產(chǎn)物通過SDS-PAGE、Western blotting印跡、質(zhì)譜及肝素親和層沉析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明利用酵母工程菌成功表達(dá)和純化了FNCHBD多肽，多肽的分子量接近32 kDa，純化產(chǎn)物的純度可達(dá)95%以上，能被FN多克隆抗體特異識(shí)別且具有多肽肝素結(jié)合活性，為后續(xù)結(jié)構(gòu)及功能的研究奠定基礎(chǔ)。

纖維連接蛋白，肝素結(jié)合域，畢赤酵母，表達(dá)純化

Abstract:To express and identify fibronectin C-terminal heparin-binding domain (FNCH BD) polypeptides inPichia pastorisexpression system and study its function, the fragment of FNCHBD was amplified by PCR and inserted into pGEM-T vector. After sequenced, the fragment was inserted into pAo815SM vector, and then cloned into the expression vector pPIC9k. The recombinant plasmid was linerarized with restrict enzymeSalI and transferred into the yeast host cell KM71 and GS115. The positive yeast clone was screened by G418 resistant, and the target protein was induced to express in the medium containing 0.5% methano1. The culture supernatant was collected and then was purified with membrane ultrafiltration and ion exchange chromatography. The purified product was analyzed with mass spectrogram, SDS-PAGE,Western blotting and heparin affinity chromatography. The results showed that the target protein was around 32 kDa and the purity of the product was above 95%. FNCHBD could be specifically recognized by fibronectin polyclonal antibody. These results suggest that FNCHBD could be expressed and purified successfully inPichia pastoris, which provides a good strategy to further studies.

Keywords:fibronectin, heparin-binding domain,Pichia pastoris, expression and purification

纖維連接蛋白 (Fibronectin，F(xiàn)N) 是一個(gè)多功能的糖蛋白，參與多種細(xì)胞的黏附、擴(kuò)展、遷移、分化、增殖及存活[1-3]，因此它在胚胎發(fā)育[4]、組織修復(fù)[5]、基質(zhì)聚集[6]、腫瘤轉(zhuǎn)移[7-8]、抗感染[9]、出血及血栓[10]、肌肉再生[11]等方面都發(fā)揮了重要作用。FN是由兩個(gè)相同單體通過二硫鍵連接組成的二聚體，每個(gè)單體由3種類型 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型) 的結(jié)構(gòu)域重復(fù)不同次數(shù)構(gòu)成。FN的結(jié)構(gòu)中含有各種生物大分子的結(jié)合位點(diǎn)，包括成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、細(xì)菌、膠原、肝素等，因此形成了多種功能結(jié)構(gòu)域，其中包含2個(gè)肝素結(jié)合域[12-13]，一個(gè)位于FN的N端，由第1～5五個(gè)Ⅰ型的同源結(jié)構(gòu)組成，與肝素的結(jié)合力較弱，另一個(gè)位于FN的C端，由第12～14三個(gè)Ⅲ型的同源結(jié)構(gòu)組成，與肝素的結(jié)合力較強(qiáng)[12]。血漿FN在抑制腫瘤遷移、抗感染及損傷修復(fù)等方面的作用已經(jīng)得到了廣泛的肯定。但從血漿分離FN存在著血漿資源的浪費(fèi)及可能傳播血源性傳染病的問題，同時(shí)由于FN分子量大，表達(dá)全長(zhǎng) FN分子又存在技術(shù)上的難題，因此表達(dá) FN的功能區(qū)多肽并研究其功能是較為可行的方法。我們前期研究已合成了FN N端的肝素結(jié)合域多肽，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明其具有抗小鼠敗血癥及大鼠DIC的作用[14-15]。目前國(guó)際上對(duì)FN C端的肝素結(jié)合域的生物學(xué)功能有了較深入的研究，如促進(jìn)細(xì)胞粘附[16-17]、促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活性[18]、促進(jìn)血管的生成[19]、調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[20]、抗感染[21]等；但表達(dá)FN C端的肝素結(jié)合域多肽目前國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。FN C端的肝素結(jié)合域含 272個(gè)氨基酸 (Tyr1720-Gly1991)，編碼該多肽的DNA序列從5 428 bp～6 244 bp，長(zhǎng)816 bp，本實(shí)驗(yàn)成功地通過酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FN C端的肝素結(jié)合域多肽并進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究結(jié)構(gòu)及功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

FN cDNA、大腸桿菌 DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，pGEM-T TA克隆試劑盒、酵母表達(dá)系統(tǒng) (包括表達(dá)載體及酵母菌株及培養(yǎng)基) 購(gòu)自Invitrogen公司，pAo815SM 載體由廈門特寶公司提供，PrimeSTART HSDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；pUC8、pUC18 DNA Marker、EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為 Promega公司產(chǎn)品；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker LMW購(gòu)自GE公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Qiagen公司，兔抗人FN多克隆抗體、羊抗兔IgG購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品；1 mL的肝素親和層析預(yù)裝柱HiTrap Heparin HP購(gòu)自GE公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2 目的基因的 PCR擴(kuò)增和 pGEM-TFNCHBD載體的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室所保存的FNcDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物 (M1、M2，↓箭頭表示酶切位點(diǎn)，下劃線表示KEX2信號(hào)肽水解位點(diǎn))，具體序列見表1，通過PCR擴(kuò)增FNCHBD基因片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)855 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后經(jīng)末端加A，連接至 pGEM-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性和藍(lán)白篩選挑白色克隆進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行 PCR和XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序。

表1 引物DNA序列Table 1 DNA sequence of primers

1.3 重組pAo815SM-FNCHBD質(zhì)粒的構(gòu)建

為增加目的基因的拷貝數(shù)，將測(cè)序正確的重組pGEM-T-FNCHBD質(zhì)粒由XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后回收目的 DNA，然后克隆入用同樣酶切處理的 pAo815SM 載體上，構(gòu)建質(zhì)粒pAo815SM-FNCHBD，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化菌涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素 (Amp) 的低鹽 LB固體培養(yǎng)基平板上。挑選單個(gè)菌斑擴(kuò)增，提取質(zhì)粒酶切鑒定。

1.4 重組pPIC9K-FNCHBD表達(dá)載體的構(gòu)建

將鑒定正確的重組 pAo815SM-FNCHBD質(zhì)粒由EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后膠回收目的基因，然后克隆到用同樣酶切的 pPIC9K載體上，重組pPIC9K-FNCHBD載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑單菌斑擴(kuò)增，提質(zhì)粒酶切鑒定。

1.5 FNCHBD多肽在酵母細(xì)胞中的表達(dá)

1.5.1 FNCHBD多肽在酵母細(xì)胞GS115中的表達(dá)

SalⅠ酶切線性化重組 pPIC9K-FNCHBD質(zhì)粒 (pPIC9K-FNCHBD/SalⅠ)。線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GS115，轉(zhuǎn)染的GS115細(xì)胞涂布RDB平板上，28 ℃培養(yǎng)96 h，收取RDB平板上的菌落，涂于濃度分別為1～4 g/L的G418-YPD平板上，挑取4 g/L G418-YPD平板上的菌落分別接種至5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min 振搖24 h后轉(zhuǎn)接于裝有30 mL含0.25%甲醇的BMGY培養(yǎng)基，28 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每12 h添加甲醇至濃度為0.25%，48 h后發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、離心 30 min (10 000 r/min)，留取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.5.2 FNCHBD多肽在酵母細(xì)胞KM71中的表達(dá)

線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 KM71酵母細(xì)胞,轉(zhuǎn)染的KM71細(xì)胞涂布于RDB平板上，28 ℃培養(yǎng)120 h，收取RDB平板上的菌落，涂于濃度分別為1～4 g/L的G418-YPD平板上，挑取4 g/L G418-YPD平板上的菌落分別接種至5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min振搖24 h后轉(zhuǎn)接于裝有含0.25%甲醇的30 mL BMGY培養(yǎng)基，28 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每12 h添加甲醇至濃度為0.25%，誘導(dǎo)表達(dá)72 h后發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心30 min，留取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.6 FNCHBD多肽的純化

挑選表達(dá)較好的 KM71-FNCHBD菌株接種于300 mL BMGY培養(yǎng)基擴(kuò)大發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)條件同上，72 h后發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清，上清用10 kDa、容積為300 mL的中空纖維膜超濾濃縮后至1/10體積后用5 L 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 的緩沖液置換，然再過用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 預(yù)平衡過的 CM Sepharose FF離子交換柱純化，用50 mmol/L Tris HCl、350 mmol/L NaCl的洗脫液(pH 8.0) 洗脫，監(jiān)測(cè) UV280的波形，收集含目的蛋白的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，初步純化的樣品進(jìn)一步經(jīng)Sephacryl S-100HR分離純化，純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳檢測(cè)產(chǎn)物的純度。

1.7 FNCHBD的鑒定和活性分析

1.7.1 通過質(zhì)譜分析測(cè)定多肽的分子量

將純化的 FNCHBD多肽產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜儀測(cè)定多肽的分子量及純度。

1.7.2 Western blotting方法鑒定多肽的抗原性

按 Western blotting常規(guī)方法制膠，將過HiTrap Heparin HP柱子的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，350 mA穩(wěn)流1 h轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用封閉液 (5%的封閉蛋白的 0.01 mol/L，pH 7.4 PBS，0.05%Tween20) 室溫作用1.5 h后加一抗(兔抗人FN多克隆抗體1∶500) 4 ℃包被過夜，TBS漂洗3次，每次5 min，加二抗 (羊抗兔lgG 1∶5 000)，室溫?fù)u1.5 h后TBS漂洗3次，加AB工作液 (1∶1) 后X光片爆光5 min，顯影，定影。

1.7.3 FNCHBD多肽的肝素親和活性鑒定

將 FNCHBD的酵母發(fā)酵液上清過用10 mmol/L的 PBS (pH 7.0) 預(yù)平衡后 1 mL的HiTrap Heparin HP柱子，用10 mmol/L的PBS、500 mmol/L的NaCl (pH 7.0) 洗脫，監(jiān)測(cè)UV280的波形，收集活性峰，小量處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 FNCHBD多肽基因的克隆和T載體的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室保存的 FNcDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見FNCHBD多肽基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在700 bp的上方有特異性條帶，片段大小與預(yù)計(jì)的 855 bp相符(圖1)?；厥盏腜CR產(chǎn)物與T載體連接，重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定正確后，經(jīng)測(cè)序表明插入的 FNCHBD多肽基因與基因庫(kù)中的完全相符。

圖1 FNCHBD基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR product of FNCHBD. M: DNA marker; 1:FNCHBD.

2.2 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切 pGEM-T-FNCHBD載體，酶切目的片段，回收后與pAo815SM連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選平板上的抗性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，構(gòu)建的 pAo815SM-FNCHBD載體經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切目的片段與pPIC9K酵母表達(dá)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選平板上的抗性菌落，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，所切下的片段與預(yù)期結(jié)果相符 (圖2)，說明成功構(gòu)建pPIC9K-FNCHBD表達(dá)載體。

2.3 FNCHBD多肽在酵母細(xì)胞中的表達(dá)

將4 g/L G418-YPD平板上的挑選的GS115

圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K-FNCHBD的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pPIC9KFNCHBD by enzyme digestion. M: pUC18 DNA marker;1?3: pPIC9K-FNCHBD digested withEcoR Ⅰ andBamHⅠ.

和KM71酵母細(xì)胞，經(jīng)上述誘導(dǎo)表達(dá)后，發(fā)酵液均經(jīng)4 ℃離心后取上清進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，可見KM71菌株在30 kDa的上方出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符，且表達(dá)的雜蛋白的本底較低 (圖3)，因此選用陽(yáng)性的KM71菌株作為擴(kuò)大規(guī)模發(fā)酵的表達(dá)菌株。

2.4 FNCHBD多肽的純化

陽(yáng)性 KM71菌株的發(fā)酵上清經(jīng)過超濾使蛋白得到濃縮，同時(shí)去掉一些小分子的雜蛋白，然后通過CM柱進(jìn)一步富集目的蛋白，使蛋白得到初步純化，最后通過S100柱分離出目的蛋白從而得到較純的蛋白，SDS-PAGE電泳可見到大小約32 kDa的目的多肽條帶 (圖4)。

2.5 FNCHBD鑒定和活性分析

將純化后的FNCHB多肽通過質(zhì)譜分析，確定其分子量為31.051 kDa，與用PROSIS軟件分析的理論預(yù)計(jì)值相符 (圖5)，證明所得到的多肽為目的蛋白，純化后樣品的純度＞95%，為今后的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。Western blotting法顯示在與SDS-PAGE的FNCHBD條帶相應(yīng)的位置出現(xiàn)清晰的條帶 (圖6)，表明FNCHBD多肽可與FN的多克隆抗體結(jié)合，具有免疫原性，同時(shí)也進(jìn)一步證明了所表達(dá)純化的多肽是目的多肽。FNCHBD少量發(fā)酵上清過 1 mL的 HiTrap Heparin HP柱子，洗脫時(shí)監(jiān)測(cè) UV280的波形(圖 7)，出峰時(shí)收集的樣品行SDS-PAGE電泳可目的蛋白條帶 (圖8)。表明通過FNCBHD多肽具有肝素結(jié)合活性，能夠通過肝素親和層析純化。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物FNCHBD多肽的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expressed FNCHBD. M: low molecular protein marker LMW; 1?10: supernatant liquid of GSll5/pPIC9K-FNCHBD; a?g: supernatant liquid of KM71/pPIC9K-FNCHBD.

圖4 FNCHBD多肽純化過程的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of samples collected at different stages of FNCHBD purification. M: Low molecular protein marker (LMW); 1, 2: fraction eluted from Sephacryl S-100HR; 3: fraction eluted from CM Sepharose FF; 4: dialyzed supematant of KM71/pPlC9K-FNCHBD.

圖5 純化的FNCHBD多肽的質(zhì)譜圖Fig.5 MS of recombinant FNCHBD.

圖6 純化的FNCHBD多肽的SDS-PAGE和Western blotting分析Fig.6 SDS-PAGE and Western blotting analysis of purified FNCHBD. M: low molecular protein marker(LMW); 1: SDS-PAGE analysis of purifed FNCHBD;2: Western blotting analysis of purified FNCHBD.

圖7 FNCHBD發(fā)酵液上清的肝素親和層析圖Fig.7 Diagram of heparin affinity chromatography of supernatant liquid of KM71/pPIC9K-FNCHBD.

圖8 肝素親和層析產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis of fraction eluted from HiTrap Heparin HP. M: low molecular protein marker(LMW); 1: fraction eluted from HiTrap Heparin HP.

3 討論

酵母是一種低等真核生物，既具有類似原核生物的生長(zhǎng)特性，又具有一般真核生物的分子和細(xì)胞生物學(xué)特性。酵母作為基因工程的表達(dá)系統(tǒng)，無細(xì)菌細(xì)胞壁的熱原問題，也不必考慮動(dòng)物細(xì)胞中可能含有原癌基因及病毒DNA等影響，其中畢赤酵母因具備良好的發(fā)酵與分泌性能尤其引人注目。畢赤酵母作為甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，該表達(dá)系統(tǒng)使用的乙醇氧化酶基因 (AOXl) 啟動(dòng)子為強(qiáng)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在AOXl啟動(dòng)子控制下的外源基因表達(dá)水平高且便于調(diào)控，重組株可按需要在誘導(dǎo)前高密度生長(zhǎng)，加入甲醇誘導(dǎo)后能高水平表達(dá)，表達(dá)外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，具有糖基化、?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能，使生產(chǎn)的蛋白具有天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性；發(fā)酵工藝成熟，易放大，產(chǎn)物易純化，所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價(jià)，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機(jī)鹽，成本遠(yuǎn)低于昆蟲和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。因此，將外源基因整合于畢赤酵母染色體上，蛋白表達(dá)含量高、表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性好、背景蛋白質(zhì)少、操作簡(jiǎn)便及易于工業(yè)化生產(chǎn)[22-23]。近年來畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的范圍越來越廣泛，人們已經(jīng)用畢赤酵母表達(dá)體系成功表達(dá)了500多種蛋白[24]，包括疫苗、激素、干擾素、抗菌肽、酶、膜受體蛋白、細(xì)菌毒素及其衍生物等。因此本文嘗試用該系統(tǒng)進(jìn)行FN C端肝素結(jié)合域 (FNCHBD) 多肽的表達(dá)研究并取得了成功。

在本研究中，我們將 FNCHBD基因插入T載體上通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌抽提質(zhì)粒，使目的基因進(jìn)一步擴(kuò)增及易于酶切獲得粘性末端，然后通過pAo815SM中間載體增加目的基因的拷貝數(shù)，最后將目的基因插入 pPIC9K酵母表達(dá)載體α-factor信號(hào)肽的下游，構(gòu)建成FNCHBD基因的重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-FNCHBD，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞GS115和KM71，獲得陽(yáng)性重組菌株。由于pPIC9K質(zhì)粒所帶Kanamycin抗性基因在酵母中表現(xiàn)為抗G418的抗性，利用這一點(diǎn)可以用來篩選多拷貝的菌株，因此本實(shí)驗(yàn)通過將初步篩選的陽(yáng)性酵母菌株再涂布于濃度分別為 1～4 g/L的G418-YPD平板上，在4 g/L的G418-YPD平板上篩選出高拷貝數(shù)的菌株。由于目的基因插入到α-factor信號(hào)肽的下游，因此在甲醇的誘導(dǎo)下，目的基因表達(dá)產(chǎn)物分泌于酵母培養(yǎng)上清液中，由于在目的基因中引入的KEX2蛋白酶的酶切點(diǎn)，減少了額外氨基酸的加入。表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其分子量與prosis軟件分析的預(yù)計(jì)值相符，且KM71陽(yáng)性菌株中目的蛋白的表達(dá)量較高且背景蛋白較少，因此選用KM71陽(yáng)性菌株作為我們下一步實(shí)驗(yàn)的菌株。經(jīng)擴(kuò)大規(guī)模發(fā)酵后，發(fā)酵液離心后所得的上清經(jīng)過超慮使蛋白得到濃縮，同時(shí)去掉一些小分子的雜蛋白，然后通過CM離子交換柱進(jìn)一步富集目的蛋白，使目的蛋白得到初步純化，最后通過S100離子交換柱分離出目的蛋白從而得到較純的蛋白，通過SDS-PAGE及質(zhì)譜顯示，所純化蛋白的分子量約為32 kDa，且純化蛋白的純度達(dá)95%以上，最后通過 Western blotting法和肝素親和層析法證明純化的目的多肽具有免疫原性和肝素結(jié)合活性，以上充分表明了我們成功地在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和純化了 FNCHBD多肽，且表達(dá)的多肽具有抗原結(jié)合和肝素結(jié)合活性，這為后續(xù)FNCHBD的結(jié)構(gòu)和功能實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Yamada KM. Fibronectin peptides in cell migration and wound repair. J Clin Invest, 2000, 105(11):1507?1509.

[2] Hynes RO. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell, 2002, 110(6): 673?687.

[3] Kang W, Park S, Jang JH. Kinetic and functional analysis of the heparin-binding domain of fibronectin. Biotechnol Lett, 2008, 30(1): 55?59.

[4] Hynes RO. Fibronectins. New York: Springer-Verlag,1990: 333?348.

[5] Sakai T, Johnson KJ, Murozono M, et al. Plasma fibronectin supports neuronal survival and reduces brain injury following transient focal cerebral ischemia but is not essential for skin wound healing and hemostasis. Nat Med, 2001, 7(3): 324?330.

[6] Mao Y, Schwarzbauer JE. Fibronectin fibrillogenesis: a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biol, 2005, 24(6): 389?399.

[7] Yi M, Ruoslahti E. A fibronectin fragment inhibits tumor growth, angiogenesis, and metastasis. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(2): 620?624.

[8] Labat-Robert J. Fibronectin in malignancy. Semin Cancer Biol, 2002, 12(3): 187?195.

[9] Liu X, Collodi P. Novel form of fibronectin from zebrafish mediates infectious hematopoietic necrosis virus infection. J Virol, 2002, 76(2):492?498.

[10] Adili R, Hong Yang, Guangheng Zhu, et al.Plasma fibronectin depletion enhances platelet aggregation and thrombus formation in mice lacking fibrinogen and vonWillebrand factor. Blood, 2009, 113(8):1809?1817.

[11] Vaz R, Martins GG, Thorsteinsdottirs S, et al.Fibronectin promotes migration, alignment and fusion in anin vitromyoblast cell model. Cell Tissue Res, 2012, 348(3): 569?578.

[12] Roumen P, Kenneth MY. Fibronectin at a glance.Cell Science, 2002, 115(20): 3861?3863.

[13] Iwona WP, Jean ES. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. J Cell Sci, 2003, 116(16):3269?3276.

[14] Zou QY, Guo JR, Chen XF, et al. Preparation of recombinant polypeptide of N-terminal heparin binding domain of fibronectin and its effect on disseminated intravascular coagulation in rats. J Experi Hemaol, 2010, 18(3): 698?703.

鄒起練, 郭江睿, 陳小芳, 等. 纖維連接蛋白 N端肝素結(jié)合域多肽的制備及其對(duì) DIC大鼠的治療作用. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2010, 18(3):698?703.

[15] Zou QY, Guo JR, Chen XF, et al. Recombinant polypeptide of N-terminal heparin binding domain of fibronectin antogonizes hepatic failure induced by endotoxin in mice. Natl Med J China, 2009,89(48): 3425?3429.

鄒起練, 郭江睿, 陳小芳, 等. 組纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽抗內(nèi)毒素所致小鼠肝衰竭的作用. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 89(48): 3425?3429.

[16] Kim JH, Park SO, Jang HJ, et al. Importance of the heparin-binding domain of fibronectin for enhancing cell adhesion activity of the recombinant fibronectin. Biotechnol Lett, 2006, 28(17):1409?1413.

[17] Kang W, Park S, Janq JH. Kinetic and functional analysis of the heparin binding domain of fibronectin. Biotechnol Lett, 2008, 30(1): 55?59.

[18] Wijelath ES, Rahman S, Namekata M, et al.Heparin-II domain of fibronectin is a vascular endothelial growth factor-binding domain:enhancement of VEGF biological activity by a singular growth factor matrix protein synergism.Circ Res, 2006, 99(8): 853?860.

[19] Viji RI, Kumar VB, Kiran MS, et al. Angiogenic response of endothelial cells to heparin-binding domain of fibronectin. Biochem Cell Biol, 2008,40(2): 215?226.

[20] Kapila YL, Wang S, Dazin P, et al. The heparin-binding domain and V region of fibronectin reglate apoptosis by suppression of p53 and c-myc in human primary cells. J Biol Chem, 2002,277(10): 8482?8491.

[21] Andersson E, Rydengard V, Sonesson A, et al.Antimicrobial activities of heparin-binding peptides. Eur Biochem, 2004, 271(16): 1219?1226.

[22] Romanos M. Advances in the use ofPichia pastorisfor high level gene expression. Curr Opin Biotechnol, 1995, 6(5): 527?533.

[23] Faber KN, Hader W, Ab G, et al. Methylotrophic yeasts as factories for the production of foreign proteins. Yeast, 1995, 11(14): 1331?l334.

[24] Maeauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, et a1.Heterologous protein production using thePichia pastorisexpression system. Yeast, 2005, 22(4):249?270.

Expression, purification and identification for fibronectin C-terminal heparin-binding domain polypeptide inPichia pastoris

Xiaofang Chen1, Xianling Chen1, Qilian Zou2, Yong Wu1, and Yuanzhong Chen1

1Fujian Institute of Hematology,Affiliated Union Hosptal,Fujian Medical University,Fuzhou350001,Fujian,China
2Department of Cell Biology and Genetics,Basic Medical College Fujian Medical University,Fuzhou350004,Fujian,China

陳小芳, 陳顯凌, 鄒起練, 等. 纖維連接蛋白 C端肝素結(jié)合域多肽在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2012,28(10): 1265?1273.

Chen XF, Chen XL, Zou QL, et al. Expression, purification and identification for fibronectin C-terminal heparin-binding domain polypeptide inPichia pastoris. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1265?1273.

Received:April 6, 2012;Accepted:July 24, 2012

Supported by:Science and Technology Innovation Platform Construction Project of Fujian Province (No. 2009J1004).

Corresponding author:Yuanzhong Chen. Tel: +86-591-83357896; E-mail: chenyz@pub.fjmu.edu.cn

福建省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目 (No. 2009J1004) 資助。