王剛，連忠輝，田文洪,，董小巖，尉遲捷，吳小兵,4

1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

2 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012

3 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所，北京 100176

4 北京亦莊國(guó)際生物醫(yī)藥投資管理有限公司，北京 100111

生物技術(shù)與方法

建立分泌型熒光素酶基因標(biāo)記的原位肝癌模型及用于干擾素β基因治療評(píng)價(jià)

王剛1，連忠輝2，田文洪1,2，董小巖3，尉遲捷1，吳小兵1,4

1 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

2 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012

3 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所，北京 100176

4 北京亦莊國(guó)際生物醫(yī)藥投資管理有限公司，北京 100111

旨在建立一種分泌型熒光素酶基因標(biāo)記的小鼠原位移植型肝癌模型并觀察其對(duì)干擾素 β基因治療的反應(yīng)。首先建立穩(wěn)定表達(dá)分泌型熒光素酶Gluc (Gaussia princepsluciferase) 的小鼠肝癌細(xì)胞Hepa 1-6/Gluc;將該細(xì)胞通過(guò)脾注射至C57BL/6小鼠肝臟建立原位移植型肝癌模型，通過(guò)檢測(cè)外周血Gluc活性監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況；用此模型觀察水動(dòng)力注射干擾素β質(zhì)粒DNA的抗腫瘤效果。結(jié)果表明，通過(guò)脾注射Gluc基因標(biāo)記的Hepa 1-6細(xì)胞可以建立小鼠原位移植型肝癌模型;外周血Gluc活性可以有效反映體內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和腫瘤的生長(zhǎng)情況;通過(guò)監(jiān)測(cè)外周血Gluc活性可靈敏反映干擾素β基因治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。本研究表明，利用Gluc為報(bào)告基因建立的小鼠原位移植型肝癌模型可以體外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，并能靈敏可靠地用于抗腫瘤治療效果的評(píng)價(jià)。

熒光素酶，Gluc，肝癌模型，IFN-β，基因治療

Abstract:To establish an orthotopic transplant mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) labeled with secretary luciferase and to study its response to anti-tumor treatment with interferon-β gene therapy. We labeled the murine hepatoma Hepa1-6 cells with secretaryGaussia princepsluciferase (Gluc), and then injected Gluc labeled Hepa1-6 cells intrasplenically in C57BL/6 mice. We monitored blood Gluc to evaluate the tumor development and anti-tumor effects of hydrodynamic injection with interferon-β expressing plasmid. We successfully established the orthotopic mouse model of HCC by intrasplenic injection of Gluc labeled Hepa1-6 cells. The Gluc blood assay could reflect the amount of cancer cellsin vivo, tumor progression, as well as anti-tumor effect of interferon-β gene therapy. In conclusion, Gluc labeled orthotopic transplant mouse model of HCC canex vivoreal-time monitor the tumor development and tumor response to treatments.

Keywords:luciferase, Gluc, model of hepatocellular carcinoma, IFN-β, gene therapy

肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC，簡(jiǎn)稱肝癌) 是最為常見(jiàn)的肝臟原發(fā)惡性病變。動(dòng)物肝癌模型是研究腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及抗腫瘤藥物開發(fā)的重要工具。通常情況下，模型體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況的監(jiān)測(cè)是比較困難的，腫瘤需要生長(zhǎng)到一定程度才能在體外觸及，往往需要在不同時(shí)間處死動(dòng)物才能測(cè)量腫瘤大小，因此難以獲得連續(xù)的腫瘤生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。這為研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，尤其給腫瘤治療效果的評(píng)價(jià)造成了不便。

Gluc是一種來(lái)自于海洋撓腳類動(dòng)物Gaussia princeps的分泌型熒光素酶[1]，是一個(gè)理想的體外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)生物學(xué)過(guò)程的報(bào)告基因[2-3]。通過(guò)檢測(cè)外周血中的 Gluc已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了方便地監(jiān)測(cè)接種在動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和肝母細(xì)胞瘤[2-5]。我們?cè)噲D建立以Gluc為報(bào)告基因的小鼠原位移植型肝癌模型，用以方便靈敏地體外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況，并嘗試用這種模型實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)腫瘤治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

含有neo基因并以 CAG (Cytomegalovirus enhancer，chicken β-actin promoter，β-globin poly A signal) 為啟動(dòng)子的 Gluc真核表達(dá)質(zhì)粒pAAV2neo-CAG-Gluc、人干擾素 β (Interferon-β，IFN-β) 真核表達(dá)質(zhì)粒 pAAV2neo-CAG-IFN-β 和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (Enhanced green fluorescent protein，EGFP) 真核表達(dá)質(zhì)粒 pAAV2neo-CAGEGFP由本室構(gòu)建和保存。來(lái)源于C57L小鼠的肝癌細(xì)胞株Hepa 1-6購(gòu)自美國(guó)ATCC，由本室保存。3～4周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和脂質(zhì)體 Lipofectamine? 2000購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；G418和戊巴比妥鈉購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；Gaussia熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)NEB公司；VeriKine-HS? Human IFN-β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)PBL公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和篩選

Hepa 1-6細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于 5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用脂質(zhì)體lipofectamine? 2000按說(shuō)明書將 pAAV2neo-CAG-Gluc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hepa 1-6細(xì)胞，用含G418(400 μg/mL) 的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d，獲得穩(wěn)定表達(dá)Gluc的Hepa 1-6細(xì)胞 (Hepa 1-6/Gluc)。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和培養(yǎng)上清中 Gluc活性測(cè)定

取Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞，接種于24 孔板，接種密度為5×103cell/孔，每天更換培養(yǎng)基。接種后1～8 d，每天取3孔細(xì)胞的培養(yǎng)上清，用PBS緩沖液稀釋100倍后取2.5 μL使用Gaussia 熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用發(fā)光檢測(cè)儀收集 10s光信號(hào)并測(cè)定其相對(duì)光強(qiáng)度(Relative light units，RLU)。然后用胰蛋白酶消化上述3孔細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞數(shù)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 脾注射法制備小鼠原位肝癌模型

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa 1-6細(xì)胞，常規(guī)消化、吹打，盡量分散細(xì)胞。用 PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，并計(jì)數(shù)，最終用 PBS緩沖液稀釋成1×107cell/mL濃度的細(xì)胞懸液，置于4 ℃?zhèn)溆?。?～4周齡雄性C57BL/6小鼠，按照75 mg/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉。小鼠右側(cè)臥位，固定于鼠板，常規(guī)消毒，于背側(cè)中部、左側(cè)腋中線與腋后線間剪開約0.5～0.8 cm左右切口，完全游離脾臟，用 30 G的胰島素注射器吸取100 μL 的 Hepa 1-6 細(xì)胞懸液 (1×106cell)，于脾臟上極沿脾臟縱軸進(jìn)針，緩慢注入脾內(nèi)，結(jié)扎脾蒂切除脾臟，全層縫合腹壁。

1.5 外周血Gluc活性檢測(cè)

小鼠接種Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞后，尾靜脈采血2.5 μL，加入Gaussia 熒光素酶檢測(cè)試劑盒中的底物50 μL，使用發(fā)光檢測(cè)儀收集10s光信號(hào)并測(cè)定其相對(duì)光強(qiáng)度。

1.6 水動(dòng)力法體內(nèi)轉(zhuǎn)染IFN-β基因和EGFP基因并檢測(cè)其表達(dá)

取小鼠體重 10%的生理鹽水，將 10 μg的pAAV2neo-CAG-IFN-β 或 pAAV2neo-CAG-EGFP溶于其中，并于5～7 s內(nèi)經(jīng)小鼠尾靜脈快速注射入體內(nèi)。尾靜脈采血，分離血清，用 VeriKine-HS? Human IFN-β ELISA檢測(cè)試劑盒按說(shuō)明書操作檢測(cè)外周血 IFN-β水平。取小鼠肝臟制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察 EGFP在肝臟的表達(dá)。

1.7 腫瘤大體和病理

小鼠接種Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞后不同時(shí)間，觀察腫瘤大體并照相，取腫瘤組織做石蠟切片，常規(guī)HE染色觀察病理形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 Gluc標(biāo)記的Hepa 1-6細(xì)胞的鑒定

通過(guò)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Gluc的Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞株，生長(zhǎng)曲線 (圖 1A) 顯示 Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期并進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。24孔板中的細(xì)胞數(shù)目在8 d 的培養(yǎng)中從 (7.01±0.78)×103cell 增長(zhǎng)至(1.15±0.15)×106cell，增殖了 164倍。細(xì)胞培養(yǎng)上清 Gluc檢測(cè)結(jié)果顯示 (圖 1B)，Gluc活性從(5.27±0.94)×104RLU 增長(zhǎng) 至 (5.18±0.07)×106RLU，增長(zhǎng)了98倍，Gluc監(jiān)測(cè)曲線很好地體現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)的潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期；Gluc活性與細(xì)胞數(shù)兩者均數(shù)之間具有極好的相關(guān)性 (R2=0.998) (圖 1C)。以上結(jié)果說(shuō)明，Gluc能可靠、靈敏地反映體外培養(yǎng)Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞的數(shù)量和生長(zhǎng)情況。

2.2 Gluc標(biāo)記小鼠原位肝癌模型的建立

將 1×105、3×105、1×106、3×106和 1×107cell的 Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞通過(guò)脾注射接種至C57BL/6小鼠 (n=4)，在接種后2 h檢測(cè)外周血Gluc活性，觀察Gluc活性是否可靠反映接種細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1×105cell的Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞接種即可在外周血檢測(cè)到 Gluc的表達(dá)，Gluc活性隨細(xì)胞接種量的增加而升高，1×107cell的細(xì)胞接種后可達(dá)到 (3.35±0.52)×104RLU；Gluc活性與接種細(xì)胞數(shù)具有很好的相關(guān)性(R2=0.925) (圖 2A)。

然后觀察了Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞的成瘤性，1×106cell以上的Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞脾注射均可造成 100%小鼠出現(xiàn)移植型肝癌。1×106cell的Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞注射的小鼠在接種后5 d，肝表面出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的散在白色結(jié)節(jié)，多出現(xiàn)在肝緣部位。在接種后20 d，肝表面出現(xiàn)彌漫性的白色結(jié)節(jié) (圖 2B)，除肝臟外，脾臟的注射部位也出現(xiàn)了白色結(jié)節(jié) (圖2B)，其他臟器未見(jiàn)結(jié)節(jié)。

圖1 Gluc標(biāo)記的Hepa 1-6細(xì)胞 (Hepa 1-6/Gluc) 的鑒定Fig.1 Identification of the Gluc labeled Hepa 1-6 cell (Hepa 1-6/Gluc). (A) Growth curve of the Hepa 1-6/Gluc cell.(B) Time-course data of the Gluc activities in the Hepa 1-6/Gluc cell culture supernatants. (C) Correlation of the cell culture supernatant Gluc activity to the Hepa 1-6/Gluc cell number.

然后用1×106cell的Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞脾注射制作了小鼠原位肝癌模型并檢測(cè)了外周血Gluc活性的變化。由于Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞在脾臟的生長(zhǎng)會(huì)影響 Gluc監(jiān)測(cè)肝臟腫瘤的準(zhǔn)確性，因此我們?cè)谥谱髂Ｐ蜁r(shí)將脾臟進(jìn)行了切除。結(jié)果顯示 (圖 2C)，接種 2 h后外周血 Gluc活性為(1.01±0.16)×104RLU，接種 1 d 后下降至(8.29±1.4)×103RLU，從接種2 d起Gluc活性出現(xiàn)指數(shù)級(jí)升高，在18 d時(shí)達(dá)到 (6.28±1.16)×106RLU，指數(shù)增長(zhǎng)期一直持續(xù)至18～21 d，隨后Gluc增長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。模型動(dòng)物從23 d出現(xiàn)死亡，存活期為 (27.00±2.92) d。

圖2 建立Gluc標(biāo)記的原位移植型肝癌模型Fig.2 Establishment of the Gluc labeled orthotopic transplant model of HCC. (A) Correlation of the blood Gluc activity to the inoculated Hepa 1-6/Gluc cell number (n=4). (B) Tumor mass in the spleen (upper) and the liver (lower)20 d after intrasplenic injection of Hepa 1-6/Gluc cells. (C) Time-course data of the blood Gluc activity in five independent mouse models. (D) Tumor mass in the liver on 3 d, 7 d, 14 d and 21 d after intrasplenic injection of Hepa 1-6/Gluc cells. (E) Blood Gluc activities on 3 d, 7 d, 14 d and 21 d after intrasplenic injection of Hepa 1-6/Gluc cells.

為了探討外周血 Gluc水平能否反映肝臟腫瘤的生長(zhǎng)情況，分別在1×106cell的Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞接種后3 d、7 d、14 d和21 d，各取3只小鼠，觀察肝臟腫瘤大體，與外周血 Gluc活性進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示 (圖2D，E)，在接種后3 d肝臟未形成明顯結(jié)節(jié)，但肝臟表面尤其肝緣部位出現(xiàn)蒼白色，外周血 Gluc值為 (1.90±0.50)×104RLU；接種后7 d肝臟表面出現(xiàn)十幾個(gè)至數(shù)十個(gè)不等的白色結(jié)節(jié)，肝緣部位有少量結(jié)節(jié)匯合成片，外周血Gluc值為 (1.91±0.64)×105RLU；接種后14 d肝臟表面出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)，50%以上匯合成片，外周血 Gluc值為 (2.02±0.37)×106RLU；接種后 21 d肝臟表面出現(xiàn)彌漫性白色結(jié)節(jié)，幾乎不見(jiàn)正常肝組織，外周血 Gluc值為(8.79±1.27)×106RLU。上述結(jié)果顯示，外周血Gluc活性隨腫瘤的生長(zhǎng)而升高，與腫瘤大體符合，可以客觀反映肝臟腫瘤的生長(zhǎng)情況。

2.3 利用Gluc實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝癌模型對(duì)干擾素β基因治療的反應(yīng)

隨后我們對(duì)建立的肝癌模型進(jìn)行了干擾素β的基因治療，小鼠接種 1×106cell的 Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞后 5 d，通過(guò)尾靜脈水動(dòng)力注射10 μg的 pAAV2neo-CAG-IFN-β 質(zhì)粒 (n=5) 和對(duì)照質(zhì)粒 pAAV2neo-CAG-EGFP (n=5)，探討通過(guò)監(jiān)測(cè)外周血 Gluc水平能否可靠反映抗腫瘤治療的效果。

首先檢測(cè)了EGFP和IFN-β在小鼠模型中的表達(dá)情況。水動(dòng)力注射后24 h做肝臟冰凍切片，熒光顯微鏡觀察后做HE染色區(qū)別肝組織和腫瘤組織。結(jié)果見(jiàn)圖3A，HE染色顯示在正常肝組織中出現(xiàn)數(shù)個(gè)腫瘤團(tuán)塊；熒光顯微鏡觀察顯示水動(dòng)力注射造成約30%的肝細(xì)胞表達(dá)了EGFP，而所有腫瘤組織中未見(jiàn)綠色熒光。這說(shuō)明水動(dòng)力注射質(zhì)粒至小鼠移植型肝癌模型能造成外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)正常肝臟組織，而不能轉(zhuǎn)導(dǎo)肝癌組織。小鼠模型水動(dòng)力注射IFN-β表達(dá)質(zhì)粒后24 h外周血中IFN-β 的檢測(cè)值為 (3 362±605) pg/mL。

外周血Gluc監(jiān)測(cè)結(jié)果 (圖3B) 發(fā)現(xiàn)，Hepa 1-6/Gluc細(xì)胞接種后，外周血Gluc活性與先前的研究結(jié)果一致，1 d后出現(xiàn)輕度的下降，從 2 d起進(jìn)入指數(shù)級(jí)的增長(zhǎng)，在第5 d給予IFN-β基因治療前 Gluc活性為 (8.17±1.89)×104RLU。EGFP對(duì)照組小鼠在質(zhì)粒注射后，外周血 Gluc活性仍呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，直至18～21 d進(jìn)入平臺(tái)期，隨后出現(xiàn)小鼠死亡。與EGFP對(duì)照組相比，IFN-β注射組的3只小鼠在治療后4 d出現(xiàn)Gluc活性的明顯抑制，隨后出現(xiàn)迅速下降，分別在21～24 d時(shí)降至陰性水平 (＜300 RLU)；IFN-β組的另2只小鼠 Gluc活性也出現(xiàn)一定程度的抑制，但仍持續(xù)升高，直至小鼠死亡。觀察小鼠的生存情況(圖3C) 顯示，EGFP對(duì)照組小鼠在50 d的觀察期內(nèi)全部死亡，平均生存期為21.60 d；而IFN-β組存活率為60%，Gluc轉(zhuǎn)陰的3只小鼠均未出現(xiàn)死亡，2只死亡小鼠的平均生存期為27.50 d，較對(duì)照組延長(zhǎng)。治療50 d后觀察Gluc轉(zhuǎn)陰的小鼠肝臟大體情況，發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤消失，肝組織HE染色未見(jiàn)腫瘤組織 (圖3D)。IFN-β注射組中腫瘤獲得清除的 3只小鼠治療后 20 d外周血IFN-β 的檢測(cè)值為 (2 475±589) pg/mL，而腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)的2只小鼠外周血IFN-β的檢測(cè)值明顯降低，分別為413 pg/mL和陰性 (＜250 pg/mL)，這可能是腫瘤生長(zhǎng)造成正常肝細(xì)胞不能良好表達(dá) IFN-β。上述結(jié)果說(shuō)明，IFN-β基因治療有效抑制了小鼠肝癌模型中腫瘤的生長(zhǎng)，甚至可以完全清除肝癌細(xì)胞，外周血 Gluc活性靈敏可靠地反映了IFN-β的抗腫瘤治療效果。

圖3 利用Gluc監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)干擾素β基因治療的反應(yīng)Fig.3 Using Gluc to monitor tumor response to the interferon-β gene therapy. (A) Expression of EGFP in the tumor and the liver for the mouse model hydrodynamic injection with EGFP expressing plasmid (arrows indicate tumors).(left) Fluorescence (100×), (right) HE staining (100×). (B) Blood Gluc activities for independent mouse models with hydrodynamic injection of IFN-β or EGFP expressing plasmid (n=5). (C) Survival curve in IFN-β treated mouse models vs EGFP control animals (n=5). (D) Liver mass (left) and HE staining (200×) (right) for IFN-β treated mouse models surviving beyond 50 d.

3 討論

傳統(tǒng)的原位移植型肝癌模型難以實(shí)現(xiàn)無(wú)侵入性的、實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，限制了對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究和治療效果的評(píng)價(jià)。利用熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞并結(jié)合動(dòng)物活體成像定位和監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)可以一定程度解決這個(gè)困難，但需要注射底物和麻醉動(dòng)物，并且光學(xué)信號(hào)需要透過(guò)組織得到接收，使得精確性較差[2-6]。目前仍需要更靈敏和更方便的方法實(shí)現(xiàn)體外監(jiān)測(cè)動(dòng)物模型體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況。因此，本研究嘗試以分泌型熒光素酶Gluc為報(bào)告基因，建立可以體外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況的小鼠原位移植型肝癌模型。Gluc具有極高的靈敏度，較螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶靈敏2 000倍，較分泌型堿性磷酸酶靈敏20 000倍[1-3]。Gluc可以分泌入血，通過(guò)尾靜脈微量采血測(cè)定 Gluc活性可以方便地監(jiān)測(cè)體內(nèi)生物學(xué)過(guò)程[2-3]。Gluc在血液中具有很短的半衰期 (大約20 min)，不會(huì)隨時(shí)間而積累，可以得到體內(nèi)的實(shí)時(shí)信息[2-3]。Gluc已經(jīng)開始用于體外監(jiān)測(cè)體內(nèi)生物學(xué)情況，比如實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤模型中腫瘤的生長(zhǎng)[2-6]、小鼠體內(nèi)基因表達(dá)[7-8]和肝臟miRNA活性[9]。

選擇來(lái)源于 C57L小鼠的肝癌細(xì)胞系 Hepa 1-6作為肝癌模型的接種細(xì)胞。利用 Gluc標(biāo)記Hepa 1-6細(xì)胞后，體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)上清中 Gluc活性可以靈敏可靠地反映細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。將1×106cell的Gluc標(biāo)記Hepa 1-6細(xì)胞通過(guò)脾注射至C57BL/6小鼠肝臟成功造成了原位移植型肝癌模型。由于脾臟也出現(xiàn)了腫瘤結(jié)節(jié)，因此我們?cè)谄⒆⑸浜髮⑵⑴K進(jìn)行了切除。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠模型外周血 Gluc活性既能可靠反映體內(nèi)接種的腫瘤細(xì)胞數(shù)量也能靈敏反映體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，Gluc活性與腫瘤的大體情況一致。我們成功利用 Gluc為報(bào)告基因建立了可以體外實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的小鼠原位移植型肝癌模型。

為證實(shí)外周血 Gluc活性能否反映抗腫瘤治療的效果，我們通過(guò)水動(dòng)力注射干擾素β表達(dá)質(zhì)粒對(duì)小鼠肝癌模型進(jìn)行基因治療。干擾素是常用的抗腫瘤細(xì)胞因子，具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤血管生成的作用[10-12]。注射干擾素β可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并且抑制肝癌的復(fù)發(fā)[13-14]。由于干擾素具有較高毒性，為實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)長(zhǎng)期維持較低血藥濃度，人們開始選擇干擾素的基因治療。利用腺相關(guān)病毒載體將IFN-β基因?qū)胄∈蟾闻K獲得了長(zhǎng)期低劑量表達(dá)IFN-β，成功預(yù)防和清除小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑色素瘤等腫瘤[15-16]。水動(dòng)力注射法是簡(jiǎn)單高效的小鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)基因方法，轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因可以高效在肝臟表達(dá)[7-9,17-18]。本研究選擇了水動(dòng)力方法注射攜帶IFN-β基因質(zhì)粒DNA至小鼠模型，進(jìn)行IFN-β基因治療。通過(guò)觀察報(bào)告基因在肝臟和腫瘤的表達(dá)，我們證實(shí)水動(dòng)力注射質(zhì)粒至移植型肝癌模型可以造成外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)正常肝臟組織，而不能轉(zhuǎn)導(dǎo)肝癌組織。水動(dòng)力注射IFN-β表達(dá)質(zhì)粒后1 d，小鼠外周血即檢測(cè)到IFN-β表達(dá)，在注射后20 d仍維持在較高水平，從而達(dá)到了長(zhǎng)期低劑量的IFN-β治療。小鼠模型給予IFN-β基因治療獲得成功，實(shí)驗(yàn)組60%的小鼠腫瘤得以完全清除。外周血Gluc活性監(jiān)測(cè)顯示治療組小鼠Gluc活性均出現(xiàn)抑制，部分小鼠 Gluc出現(xiàn)下降，直至最終檢測(cè)不到。肝臟大體和病理研究發(fā)現(xiàn)所有 Gluc陰性小鼠的腫瘤均得以完全清除。因此，外周血 Gluc活性可以靈敏可靠地反映IFN-β的抗腫瘤治療效果。

本研究通過(guò)脾注射分泌型熒光素酶 Gluc標(biāo)記的Hepa 1-6細(xì)胞在C57BL/6小鼠建立了原位移植型肝癌模型。通過(guò)檢測(cè)外周血 Gluc水平可以體外實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況并可以靈敏可靠地反映抗腫瘤治療的效果。本方法具有方便、靈敏和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單一動(dòng)物個(gè)體的長(zhǎng)期研究，有利于對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及抗腫瘤治療效果的研究。

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Application of secretary luciferase labeled orthotopic transplant model of hepatocellular carcinoma to evaluate tumor response to interferon-β gene therapy

Gang Wang1, Zhonghui Lian2, Wenhong Tian1,2, Xiaoyan Dong3,Jie Yuchi1, and Xiaobing Wu1,4

1Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing100052,China
2School of Life Science,Jilin University,Changchun130012,Jilin,China
3Beijing Five Plus Molecular Medicine Institute,Beijing100176,China
4Beijing Yizhuang International Biomedical Investment & Management Co. Ltd.,Beijing100111,China

王剛, 連忠輝, 田文洪, 等. 建立分泌型熒光素酶基因標(biāo)記的原位肝癌模型及用于干擾素β基因治療評(píng)價(jià). 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(10): 1236?1244.

Wang G, Lian ZH, Tian WH, et al. Application of secretary luciferase labeled orthotopic transplant model of hepatocellular carcinoma to evaluate tumor response to interferon-β gene therapy. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1236?1244.

Received:March 28, 2012;Accepted:May 19, 2012

Supported by:National Science and Technology Major Project (Nos. 2008ZX10002-023, 2012AA020810).

Corresponding author:Xiaobing Wu. Tel: +86-10-6352-3187; Fax: +86-10-6353-6871; E-mail: wuxb0168@vip.sina.com

國(guó)家科技重大專項(xiàng) (Nos. 2008ZX10002-023，2012AA020810) 資助。