王子強(qiáng)，魯艷芹，任秀智，王延宙，李志良，徐超，韓金祥

1 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250062

2 天津醫(yī)院，天津 300211

3 山東省省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250033

4 武清區(qū)人民醫(yī)院，天津 301700

生物技術(shù)與方法

成骨不全癥血清中骨相關(guān)microRNAs的初步篩查

王子強(qiáng)1，魯艷芹1，任秀智2，王延宙3，李志良4，徐超1，韓金祥1

1 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250062

2 天津醫(yī)院，天津 300211

3 山東省省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250033

4 武清區(qū)人民醫(yī)院，天津 301700

旨在初步篩選出成骨不全癥 (Osteogenesis imperfecta，OI) 患者血清中差異表達(dá)的骨相關(guān)microRNAs(miRNAs)，通過探討其在該疾病中的可能作用，為進(jìn)一步研究成骨相關(guān)miRNA的功能及miRNA在成骨不全癥診斷中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。首先用geNorm和NormFinder等程序挑選出適于血清miRNAs定量檢測的內(nèi)參基因，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)miRanda，Targetscan和Pictar軟件以及文獻(xiàn)報(bào)道篩選出的骨形成相關(guān)miRNAs進(jìn)行定量檢測，最后用配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩查出差異表達(dá)的骨相關(guān)miRNAs。結(jié)果顯示6個(gè)候選內(nèi)參基因在不同年齡、性別和用藥情況的成骨不全癥患者和健康個(gè)體血清中的表達(dá)穩(wěn)定性良好 (表達(dá)穩(wěn)定值M<1.5)，后經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異 (Pairwise variations) 分析確定最適內(nèi)參數(shù)目為 4個(gè) (配對(duì)差異值V4/5=0.133<0.15)，分別是 miR-16、Let-7a、snRNAU6、miR-92a。通過在 16個(gè)成骨不全癥患者以及 8個(gè)健康對(duì)照個(gè)體的血清中進(jìn)一步檢測 miR-16、Let-7a、snRNAU6和 miR-92a，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)穩(wěn)定性依然良好 (M<1.5)。對(duì)100余種骨相關(guān) miRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn) 11種 miRNAs在成骨不全癥患者血清中有差異表達(dá)(P<0.05)，并且生物信息學(xué)分析顯示這些差異表達(dá)的miRNAs 很可能在成骨不全癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成骨不全癥患者血清中存在多種差異表達(dá)的骨相關(guān)miRNAs，而且這些miRNAs很可能成為一種用于成骨不全癥血清學(xué)檢查及診斷的生物標(biāo)志物。

成骨不全癥，血清miRNAs，內(nèi)參基因，生物標(biāo)志物

Abstract:We screened differential expression bone-related microRNAs (miRNAs) in serum of patients with osteogenesis imperfect (OI). First, we selected the reference gene (s) fit for quantitative detection of serum miRNAs by using geNorm and several other programmes. Then real-time fluorescent quntitative PCR was used to detect the expression level of bone-related miRNAs gained by means of miRanda, Targetscan and Pictar softwares caculation and reading literature.Then, the results were analyzed with the matched t test. All 6 candidate reference genes had a stable expression level in serum of healthy controls and patients with different characters, and the optimal number of reference genes is 4 (miR-16,let-7a, snRNAU6, miR-92a) after Pairwise Variations analysis (V4/5=0.133<0.15). For validating the universality of expression stability, we detected the relative expression value of miR-16, let-7a, snRNAU6 and miR-92a in another 8 healthy controls and 16 patients with OI and the result revealed that the expression of 4 genes remained stable (M<1.5).After measuring serum levels of more than 100 bone-related miRNAs in patients with real-time qPCR, 11 miRNAs showed differential expression, and bioinformatic analysis suggested these altered expressional mioRNAs had possibilities to participate in the process of OI. So the experiment indicated that there existed many differential expression bone-related miRNAs in serum of patients with OI, and these miRNAs had potentials to be promising biomarkers for serologic tests and diagnosis of OI.

Keywords:osteogenesis imperfecta, serum miRNAs, reference gene, biomarker

成骨不全癥是一種在骨形成過程中以成骨細(xì)胞增殖分化異常和破骨細(xì)胞活性異常為特征的罕見異常性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，雙磷酸鹽藥物可以通過調(diào)節(jié)某些 miRNAs的表達(dá)水平來促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和抑制破骨細(xì)胞活性，進(jìn)而緩解癥狀[1]。然而對(duì)于miRNAs的異常表達(dá)是否參與了成骨不全癥的發(fā)生發(fā)展過程以及血清學(xué)檢查miRNAs能否作為對(duì)成骨不全癥的診斷依據(jù)，至今未有定論。

miRNAs是一種長約 22 nt的非編碼單鏈RNA，通過和靶基因mRNA 3￠非翻譯區(qū)序列互補(bǔ)結(jié)合抑制其翻譯，有人推測人類約有1/3的基因受miRNAs的調(diào)控。隨著對(duì)miRNAs功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs不僅可以參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，而且對(duì)骨的發(fā)生過程有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。另外，miRNAs不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)水平，也可以在外周血中發(fā)揮其生物學(xué)作用。目前已知，血清miRNAs在體內(nèi)免疫以及一些血液性疾病中都發(fā)揮重要作用[3-4]，并且，其表達(dá)水平與疾病的發(fā)生發(fā)展階段有緊密聯(lián)系[5]，提示血清 miRNAs很有可能成為一種新型的疾病生物標(biāo)志物用于疾病預(yù)測與診斷。

為了深入研究 miRNAs在成骨不全癥發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過檢測成骨不全癥患者血清中差異表達(dá)的骨相關(guān)miRNAs，試圖找到一種或幾種能表征該疾病的標(biāo)志miRNAs，為研究骨相關(guān)miRNAs的功能以及miRNAs在成骨不全癥的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Trizol LS試劑購自Invitrogen公司；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和 miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購自 TIANGEN公司；引物序列參照 QIAGEN 公司網(wǎng)站(https://www.qiagen.com/geneglobe/default.aspx)推薦序列并由華大基因合成。

1.2 儀器

NanoDrop2000c紫外/分光光度計(jì)購自Thermo Fisher Sientific公司；LightCycler 480購自Roche公司。

1.3 血液樣本

病例組 (Patients group，PG) 血液樣本采自天津醫(yī)院和山東省省立醫(yī)院確診的 22名成骨不全癥患者的清晨空腹靜脈血，男女性別比例8∶3，年齡為 (9.54±3.65) 歲。10名對(duì)照組 (Control group，CG) 的血液樣本取自本市大佛小學(xué)志愿者的清晨空腹靜脈血，男女比例 6∶4，年齡為(8.20±0.42) 歲。全部血液樣本均在2 h內(nèi)完成離心與分裝。

1.4 血清總RNA提取

抽取的新鮮血液樣本經(jīng)1 900×g離心10 min后，取200 μL上清于新的預(yù)冷離心管中。向離心管中加入750 μL Trizol LS試劑，充分混勻后室溫靜置5 min。加入200 μL三氯甲烷，漩渦振蕩30s后再室溫靜置5 min。4 ℃、12 000×g離心15 min，取其上清于另一預(yù)冷離心管中，并向其管中加入600 μL異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置 10 min。4 ℃、12 000×g離心 10 min，棄液相，沉淀用75%乙醇洗滌2次后溶于15 μL去RNA酶水中。RNA樣本質(zhì)量由2%瓊脂糖凝膠和NanoDrop2000c紫外/分光光度計(jì)進(jìn)行評(píng)估。

1.5 反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作方法，對(duì)各樣品總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于下游反應(yīng)或?20 ℃貯藏備用。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)是根據(jù) SYBR Green I嵌合熒光法的原理利用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒完成的。反應(yīng)體系為：2×miRcute miRNA預(yù)混合液5 μL；上游引物0.2 μL；下游引物0.2 μL；miRNA第一鏈cDNA 1 μL；DEPC-H2O 3.6 μL。總反應(yīng)體系為 10 μL，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 20s，60 ℃退火 20s，72 ℃延伸 20s，共45個(gè)循環(huán)。將LightCycler 480讀取的CT值利用 Q=EΔCT，計(jì)算出各基因的相對(duì)表達(dá)量 Q，后經(jīng)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子處理用于數(shù)據(jù)分析，其中E為PCR擴(kuò)增效率。

1.6 內(nèi)參基因的選擇及驗(yàn)證

選擇在性別、年齡、用藥情況差異較大的6名OI患者和2名健康個(gè)體人作為研究對(duì)象，選取 miR-16、miR-92a、miR-638、Let-7a、snRNAU6以及18S rRNA作為候選內(nèi)參基因，其中miR-16、miR-638、snRNAU6和 18S rRNA是外周血miRNAs實(shí)時(shí)定量檢測常用的內(nèi)參，miR-92a和Let-7a是在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的較穩(wěn)定表達(dá)的基因。然后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)以及geNorm和NormFinder等程序?qū)?種候選內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析，選出最優(yōu)內(nèi)參基因組合，最后在另外16個(gè)OI患者和8個(gè)健康對(duì)照個(gè)體血清中驗(yàn)證其表達(dá)穩(wěn)定性，并計(jì)算出內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化因子。

1.7 骨相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)篩查

選取在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞增殖分化過程中起重要作用的相關(guān)蛋白，后用 miRanda、Targets和 Pictar軟件找到能和靶蛋白 mRNA 3￠非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合的miRNAs，取其交集，加之文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的在骨發(fā)生過程中有調(diào)節(jié)功能的miRNAs確定待檢骨相關(guān) miRNAs。選取沒有藥物治療史的8名成骨不全癥患者血清和以性別、年齡相配比的 8名健康人血清作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，利用熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)待檢骨相關(guān)miRNAs進(jìn)行定量檢測，最后用配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出OI患者血清中差異表達(dá)的骨相關(guān)miRNAs。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因的選擇及驗(yàn)證

geNorm程序?qū)?nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析時(shí)，通常建議基因表達(dá)穩(wěn)定值M＜1.5即可認(rèn)為其表達(dá)穩(wěn)定性較好，并且 M 值越小，穩(wěn)定性越高。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)geNorm程序分析顯示，6個(gè)候選內(nèi)參基因的M值都小于1.5，且其表達(dá)穩(wěn)定性從大到小依次為snRNAU6/miR-92a (0.5228)、miR-16(0.6783)、Let-7a (0.7215)、18S rRNA (0.7708)、miR-638 (0.8617) (圖1)。最適內(nèi)參數(shù)目分析結(jié)果顯示V4/5=0.133＜0.15 (geNorm程序默認(rèn)0.15為取舍值)，即最適合內(nèi)參數(shù)目為 4個(gè)，分別為snRNAU6、miR-92a、miR-16 和 Let-7a (圖 2)。用normFinder、Bestkeeper、delta CT軟件程序分析基因表達(dá)穩(wěn)定性顯示結(jié)果和geNorm程序分析結(jié)果一致，并且用geNorm軟件程序?qū)Y選出的4個(gè)內(nèi)參在另外16個(gè)成骨不全癥患者和8個(gè)健康對(duì)照個(gè)體血清中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，4個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性依然良好 (圖3)。

圖1 6個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Fig.1 Expression stability values of 6 candidate reference genes.

圖2 最適內(nèi)參基因的數(shù)目Fig.2 Determination of the optimal number of reference genes for normalization.

圖3 4個(gè)內(nèi)參基因在8個(gè)健康個(gè)體和16個(gè)成骨不全癥患者血清中的表達(dá)穩(wěn)定值Fig.3 Expression stability values of 4 reference genes in serum of 8 healthy controls and 16 patients with OI.

2.2 骨相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)篩查

對(duì)116種骨相關(guān)miRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn)有11種miRNAs (miR-34c，miR-29a，miR-29b，miR-489，miR-133a，miR-145，miR-210，miR-1297，miR-26a，miR-30e，miR-21) 在成骨不全癥血清中出現(xiàn)差異表達(dá) (P＜0.05)，其中miR-26a、miR-30e、miR-21為上調(diào) (圖 4)。通過比較的差異倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-29a和miR-133a變化幅度最大，分別是下調(diào)了12.80和6.31倍，變化最小的是下調(diào)了0.75倍的miR-145，除此之外，其余miRNAs的變化倍數(shù)均在1.5～4之間。另外，miR-29a在病例組血清中的相對(duì)表達(dá)量普遍低于對(duì)照組 (圖 5)，而 miR-26a普遍高于對(duì)照組(圖 6)。

圖4 11個(gè)差異表達(dá)的骨相關(guān)miRNAs在健康個(gè)體和成骨不全癥患者血清中的表達(dá)情況Fig.4 Differential expression levels of eleven serum miRNAs in healthy controls and patients with OI.

圖5 miR-29a在健康個(gè)體和成骨不全癥患者血清中的表達(dá)情況Fig.5 Expression level of serum miR-29a in healthy controls and patients with OI.

圖6 miR-26a在健康個(gè)體和成骨不全癥患者血清中的表達(dá)情況Fig.6 Expression levels of serum miR-26a in healthy controls and patients with OI.

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR是一種能高效地實(shí)時(shí)檢測某種基因 mRNA表達(dá)水平的技術(shù)，目前已在實(shí)驗(yàn)室普遍使用，但也存在諸多問題，最突出的問題就是內(nèi)參基因的選擇。研究顯示，沒有一種基因是穩(wěn)定表達(dá)的，單一利用一種看家基因?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可以造成幾十倍以上的差異[6]。本實(shí)驗(yàn)利用Vandesompele在2002年編寫的一款geNorm程序篩選出4種較高表達(dá)穩(wěn)定性的基因作為實(shí)時(shí)熒光定量檢測的內(nèi)參基因。為驗(yàn)證geNorm程序分析結(jié)果的準(zhǔn)確性以及4種內(nèi)參基因穩(wěn)定穩(wěn)定的普遍性，本實(shí)驗(yàn)又通過normFinder、Bestkeeper、Delta CT method 等程序以及擴(kuò)大樣本量的方法對(duì)4種基因進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，結(jié)果顯示，snRNAU6、miR-92a、miR-16和 Let-7a在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血清中都有較好的表達(dá)穩(wěn)定性，為后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性提供了有力的證據(jù)。四個(gè)內(nèi)參基因中，miR-16是外周血檢測miRNAs最常用的內(nèi)參基因，迄今應(yīng)用于多種疾病的研究，如胃癌[7]、前列腺癌[8]、乳腺癌[9]和肝癌[10]等癌癥。snRNAU6是一種在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的核糖體 RNA，近年來也發(fā)現(xiàn)在多種疾病的外周血中能穩(wěn)定表達(dá)，如結(jié)腸直腸癌的血漿，乳腺癌的血清口腔鱗狀細(xì)胞癌的血漿以及膀胱癌的尿液中[10]。但未見 miR-92a和Let-7a的相關(guān)報(bào)道。

在篩選出的11種miRNAs中，有些因在多種腫瘤的血清中都能檢測到其差異表達(dá)而被稱為“腫瘤miRNA”，如miR-21，已被多種腫瘤疾病[11-16]作為潛在的生物標(biāo)志物用于臨床疾病預(yù)測及診斷，另外幾種 miRANs (miR-210，miR-133a，miR-26a，miR-29a，miR-34c) 也多在一些腫瘤[17-25]的血清中檢測到差異變化。雖然沒有在骨相關(guān)疾病血清中存在差異表達(dá)的相關(guān)報(bào)道，但有不少關(guān)于這些miRNAs在細(xì)胞中影響骨形成過程的研究。已知miR-29b可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，其機(jī)制是和組蛋白去乙酰化酶4，轉(zhuǎn)化生長因子 β3，人連環(huán)蛋白-β互動(dòng)蛋白1等成骨細(xì)胞分化抑制基因的 3￠非編碼端互補(bǔ)結(jié)合并抑制其表達(dá)[26]，另外，miR-29a[27]和 miR-210[28]也可分別通過抑制基因Dikkopf-1和1B型激活素A受體的翻譯來促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。在抑制成骨細(xì)胞分化方面，miR-34c[29]、miR-133a[30]和miR-489[31]是分別通過抑制轉(zhuǎn)錄因子runx2，鈣結(jié)合蛋白grancalcin、和轉(zhuǎn)錄因子runx2的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。其他幾種 miRNAs，除了 miR-21有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的作用外，其余未見相關(guān)報(bào)道。但是經(jīng)miRanda、PicTar、TargetScan三種軟件分析靶基因發(fā)現(xiàn)，miR-145、miR-30e和miR-1297不僅可以影響一些經(jīng)典的骨相關(guān)信號(hào)通路如Wnt、ERK/MEK、Hedgehog去調(diào)節(jié)骨形成過程，還可以直接作用于細(xì)胞的增殖與凋亡，所以預(yù)測這些骨相關(guān) miRNAs在細(xì)胞中也可能存在差異表達(dá)變化并且變化程度和血清中的相符合。

總之，本研究篩選出了4種在成骨不全癥患者和健康個(gè)體血清中都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因snRNAU6、miR-92a、miR-16和 Let-7a，并且通過生物信息學(xué)分析認(rèn)為初步篩查出的 11種差異表達(dá)的骨相關(guān) miRNAs很有可能作為一種生物標(biāo)志物用于成骨不全癥的診斷與研究。

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Screening of bone-related microRNAs in serum of patients with osteogenesis imperfect

Ziqiang Wang1, Yanqin Lu1, Xiuzhi Ren2, Yanzhou Wang3, Zhiliang Li4, Chao Xu1, and Jinxiang Han1

1Shandong Medicinal Biotechnology Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan250062,Shangdong,China
2Tianjin Hospital,Tianjin300211,China
3Shandong Provincial Hospital,Jinan250033,Shangdong,China
4Wuqing People's Hospital,Tianjin301700,China

王子強(qiáng), 魯艷芹, 任秀智, 等. 成骨不全癥血清中骨相關(guān)microRNAs的初步篩查. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(10): 1245?1252.

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Received:March 17, 2012;Accepted:April 17, 2012

Supported by:National Key Technology R&D Program (No. SQ2011SF12C03081).

Corresponding author:Jinxiang Han. Tel: +86-531-82919888; E-mail: samshjx@sina.com

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