惠光艷，吳廣升，關(guān)繼東，劉麗霞，賈文敏，王 濰

將組織工程技術(shù)引入牙周組織再生治療，為牙周組織缺損的修復(fù)和再生開辟了新的研究空間[1]。尋找合適的支架材料是目前牙周組織再生研究的重要方面。殼聚糖溫敏凝膠是一種新型可注射型溫敏凝膠，因其優(yōu)秀的生物學(xué)特性，如：生理中性，37℃時可以形成半固體凝膠，可降解性，對大分子藥物的緩釋性，可以作為活細(xì)胞的載體并保持細(xì)胞的活性等特點在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域得到了越來越多的關(guān)注[2-4]。但殼聚糖溫敏凝膠的孔徑一般為50 μm左右，遠(yuǎn)小于理想支架材料孔徑的要求。富含血小板血漿（PRP）含有大量的生長因子和豐富的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，孔徑較大，約為200～800 μm，并已經(jīng)作為支架材料應(yīng)用于骨組織工程中[5]。本實驗將殼聚糖溫敏凝膠與PRP共混，希望使殼聚糖溫敏凝膠孔徑不僅增大到適宜細(xì)胞生長的要求，又可以緩慢釋放PRP內(nèi)的各種生長因子，為其作為支架材料應(yīng)用于牙周組織再生進(jìn)行初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 醫(yī)用級殼聚糖（博益特生物公司，脫乙酰度91%，青島），β-甘油磷酸二鈉（Sigma，美國），牛凝血酶（Sigma，美國），48 孔板（Corning，美國），乙酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)），磁力攪拌器（正基儀器有限公司，江蘇），振蕩攪拌器（躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，上海），冷凍干燥機(jī)（FTS，System公司，美國），掃描電鏡（KYKY-2800B，中科院科學(xué)儀器廠，北京），離心機(jī)（飛鴿，北京）。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖溫敏凝膠的制備 參考文獻(xiàn) [6]，將0.2 g殼聚糖加入8 ml 0.1 mol/L乙酸溶液中，磁力攪拌器上持續(xù)攪拌2 h；0.56 g β-甘油磷酸二鈉溶于2 ml雙蒸水中后，兩種溶液冰浴15 min，并將β-甘油磷酸二鈉逐滴加入到殼聚糖溶液中，并持續(xù)攪拌10 min。獲得殼聚糖質(zhì)量濃度為2%，β-甘油磷酸二鈉質(zhì)量濃度為5.6%的殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液。

1.2.2 PRP的制備 參考文獻(xiàn)[5]靜脈抽取人全血9 ml放入含有1 ml 3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑的15 ml離心管內(nèi)，輕柔的上下翻轉(zhuǎn)離心管，使血液與抗凝劑充分混勻。采用2次法離心，常溫下1500 r/min離心10 min，將紅細(xì)胞與血漿分離，再3000 r/min離心10 min，使富含血小板血漿與乏血小板血漿分開，獲得約1 ml的富血小板血漿。

1.2.3 殼聚糖溫敏凝膠共混PRP 將方法1.2.1制備的殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液0.4、0.3和0.2 ml分別加入1.5 ml EP管中，再按順序分別加入0.2、0.3和0.4 ml的PRP，牙周探針充分?jǐn)噭蚝蟛⒃谡袷帞嚢杵髡鹗? min。這樣獲得殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液與 PRP 體積比分別為 2∶1、1∶1 和 1∶2 的共混溶液各0.6 ml，再分別加入48孔板，標(biāo)記為B、C、D組。然后將純殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液0.6 ml加入48孔板標(biāo)記為A組，純PRP溶液0.6 ml加入48孔板標(biāo)記為E組。B～E組再分別加入濃度為1000 U/ml牛凝血酶（含 0.1 g/ml CaCl2）20、30、40、60 μl，并置于37℃恒溫孵箱內(nèi)，10 min后取出放入-80℃冰箱內(nèi)凍存。

1.2.4 殼聚糖溫敏凝膠/PRP大體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察 將樣本從-80℃冰箱內(nèi)迅速取出并置冷凍干燥機(jī)內(nèi)，真空冷凍干燥48 h，然后用眼科鑷小心將樣本從48孔板中取出，從各組樣本內(nèi)部分別切取約4 mm×5 mm×3 mm大小長方形樣品，先大體觀察，然后噴金，掃描電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 殼聚糖溫敏凝膠的性能 獲得殼聚糖/β-甘油磷酸二鈉溶液較均勻透明，pH值為7.1，37℃孵箱內(nèi)約8～10 min形成凝膠。

2.2 制備PRP的檢測 將本方法制備的PRP進(jìn)行血小板計數(shù)，約濃縮前的7倍，將1000 U/ml牛凝血酶（含0.1 g/ml CaCl2）溶液按體積比1∶10加入PRP中，立即可以形成果凍樣凝膠，表明本方法成功制備出PRP。

2.3 殼聚糖溫敏凝膠/PRP大體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 殼聚糖溫敏凝膠共混PRP在37℃孵箱內(nèi)10 min仍然可以形成凝膠。如圖1所示：純殼聚糖溫敏凝膠（A組）冷凍干燥后呈白色，質(zhì)地均勻；隨著加入PRP的比例增加，共混物顏色逐漸加深，孔徑逐漸增大，斷面不規(guī)則（B～D 組）；純 PRP（E 組）孔徑最大，顏色最深，呈褐色。掃描電鏡放大200倍觀察如圖2所示：A組（純殼聚糖溫敏凝膠組）呈魚鱗狀，孔徑大小比較均勻，50 μm左右，隨著加入PRP比例增大，殼聚糖溫敏凝膠/PRP的孔徑逐漸增大，但大小不再均勻，在一定范圍內(nèi)變化，如B組（2∶1）為30～60 μm；C 組（1∶1）為 100～200 μm；D 組（1∶2）為200～300 μm；E 組（純 PRP 組）孔徑最大，為 200～500 μm。

圖1 殼聚糖溫敏凝膠/PRP大體形態(tài)（A～E組）

圖2 殼聚糖溫敏凝膠/PRP超微結(jié)構(gòu)（A～E組，×200）

3 討 論

支架材料是提供體外培養(yǎng)細(xì)胞停泊、保證其代謝產(chǎn)物交換的支架，具有模擬細(xì)胞外基質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)特性，適宜細(xì)胞粘附、增殖的環(huán)境。支架材料的孔為細(xì)胞提供了生長空間，因此孔的性能（如孔尺寸、孔隙率等）都對支架的性能有重要影響。高孔隙率是理想支架材料的基本要求，為細(xì)胞生長提供了更多的結(jié)構(gòu)空間，便于血管長入和材料的降解，有利于支架材料與環(huán)境之間的營養(yǎng)交換及新陳代謝?？讖降拇笮∫灿绊懠?xì)胞的活動，若孔徑過小則沒有足夠的空間供細(xì)胞生長和營養(yǎng)血管的長入，影響細(xì)胞分泌基質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)的滲入。有學(xué)者認(rèn)為孔徑應(yīng)>100 μm，最好在 200～400 μm?？讖椒植寂c組織的生長有關(guān)，對骨生長，要求支架孔徑在100～350 μm范圍內(nèi)[7]。殼聚糖溫敏凝膠因其良好的生物相容性，已經(jīng)被作為種子細(xì)胞及各類生長因子的載體廣泛應(yīng)用于各類組織工程中[8]，但其孔徑僅為50 μm左右，顯然不是很理想，所以筆者希望通過加入其它孔徑較大的材料來改良?xì)ぞ厶菧孛裟z。

PRP是全血經(jīng)過濃集、分離而獲得的血液制品。其特點是PRP中的血小板濃度是全血的4～5倍以上，并且含有高濃度促進(jìn)骨組織和軟組織再生修復(fù)的生長因子。羊書勇等[5]通過掃描電鏡的方法觀察PRP的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其孔徑大小約為200～800 μm。黃愛文等[9]以自體PRP和纖維蛋白膠負(fù)載骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建可注射型組織工程骨修復(fù)兔橈骨缺損并取得了良好的效果?；赑RP具有較大的孔徑和可注射性特點，能否將PRP共混于同樣具有可注射性的殼聚糖溫敏凝膠中，以便增大殼聚糖溫敏凝膠孔徑，更有利于細(xì)胞的增殖分化。本實驗通過將殼聚糖溫敏凝膠與PRP按不同體積比進(jìn)行共混，驚奇的發(fā)現(xiàn)隨著加入PRP比率增大，殼聚糖溫敏凝膠的孔徑逐漸增大，殼聚糖溫敏凝膠與PRP按1∶1的體積比 （C組）共混時，材料的孔徑達(dá)到100～200 μm；當(dāng)殼聚糖溫敏凝膠與PRP按1∶2的體積比（D組）共混時，其孔徑已經(jīng)到達(dá)200～300 μm，這樣的孔徑正好是比較適宜細(xì)胞生長的。

可注射型支架材料是目前骨及牙周組織再生工程中研究的熱門領(lǐng)域，殼聚糖溫敏凝膠是一種具有良好的生物相容性可注射型支架材料，不僅可以負(fù)載種子細(xì)胞并保持細(xì)胞的活性，而且還可以負(fù)載生長因子并緩慢釋放，國內(nèi)外學(xué)者做了很多相關(guān)研究[10,11]。PRP含有大量的生長因子，并且可以來源于自體,不會引發(fā)肝炎、艾滋病等傳染病，是十分安全的自體生長因子。PRP還可促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖，與β-磷酸三鈣、生物陶瓷、自體骨、異種骨或羥基磷灰石復(fù)合,可明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[12]及促進(jìn)牙槽骨的再生[13]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于骨及牙周組織工程中。殼聚糖溫敏凝膠和PRP均具有可注射性及良好的生物相容性，二者共混物殼聚糖溫敏凝膠/PRP又具有較理想的孔徑，相信經(jīng)過進(jìn)一步實驗，殼聚糖溫敏凝膠/PRP有希望作為支架材料在牙周組織再生發(fā)揮重要的作用。

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