戴永娟 ，和兆榮 ，胡靖鋒 ，汪 騫 ，楊紅麗 ，刁玉華 ，李春慧 ，和江明

（1.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650205；3.通?？h經(jīng)濟(jì)作物工作站，云南 通海 652700）

青花菜（Brassica oleracea var.italica），又稱西蘭花，屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica L.）植物，食用部分為花球[1]。由于其柔嫩多汁、味道鮮美以及具有防癌抗癌等功效深受廣大消費(fèi)者的喜愛。但青花菜在生產(chǎn)中常常遭受病蟲害的威脅，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和品質(zhì)。青花菜新品種“優(yōu)秀”是日本坂田公司育成的春秋兩用的早熟青花菜新品種，具有早熟、長勢旺、抗性強(qiáng)、花蕾細(xì)小濃綠、花球平滑、出口合格率高等特點(diǎn)，是目前比較理想的早熟型青花菜品種。但“優(yōu)秀”是一個(gè)Ogura蘿卜胞質(zhì)雄性不育品種，不育性、不育率和不育度均為100%，利用常規(guī)雜交育種難以實(shí)現(xiàn)其核基因所控制的優(yōu)異性狀的轉(zhuǎn)移。然而體細(xì)胞融合技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)移的有效途徑[2]。

自1960年Cocking[3]首創(chuàng)原生質(zhì)體技術(shù)，20世紀(jì)70年代中期Kartha等[4]通過葉肉細(xì)胞形成愈傷組織和再生植株，Schenck[5]第一次報(bào)道成功獲得B.oleracea和B.napa的體細(xì)胞雜種植株至今，蕓薹屬作物幾乎所有種都可由原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株[6]。在蕓薹屬內(nèi)、蕓薹屬與近緣種之間有不少獲得體細(xì)胞雜種的報(bào)道，同時(shí)非對稱融合技術(shù)在蕓薹屬內(nèi)也得到了快速發(fā)展及應(yīng)用。非對稱體細(xì)胞融合能夠克服有性雜交的障礙，解決同源染色體的配對問題，實(shí)現(xiàn)核質(zhì)和胞質(zhì)的重新組合[7-8]，而且形成的雜種通常只含有供體親本的部分染色體，因此在提高雜種的育性及縮短育種年限等方面具有一定的優(yōu)勢。近年來國內(nèi)外不少專家學(xué)者通過非對稱體細(xì)胞雜交已經(jīng)成功獲得雜種植株[9-11]。筆者旨在通過非對稱體細(xì)胞雜交途徑，將“玉皇”可育的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到“優(yōu)秀”中，以期探索青花菜進(jìn)行性狀改良的途徑，為實(shí)現(xiàn)品種改良提供可用的育種材料。

1 材料和方法

1.1 材料

“玉皇”為供體，“優(yōu)秀”為受體（日本坂田公司）。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備 青花菜原生質(zhì)體分離及純化：分別取接種于MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)5～6 d的“玉皇”、暗培養(yǎng)的“優(yōu)秀”無菌苗下胚軸，碎解成1 mm左右的小段，按50粒種子1 mL酶液，于25℃黑暗條件下，搖床上30 r/min酶解12 h，酶液的配制參考Kao等[12]。酶解后用 45 μm孔尼龍網(wǎng)過濾酶解分離原生質(zhì)體。將濾液移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入CPW-10洗液（27.2 mg/L KH2PO4、101 mg/L KNO3、246 mg/L MgSO4·7H2O、0.16 mg/L KI、0.025 mg/L CuSO4·5H2O、1 480 mg/L CaCl2·2H2O、10% 甘露醇，pH 5.8），離心清洗5 min，棄上清，重復(fù)2次。最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)基（PJ1）離心清洗1次，即可獲得純凈的青花菜原生質(zhì)體。將收集到的“優(yōu)秀”，“玉皇”原生質(zhì)體調(diào)濃度至（1～2）×106個(gè)/mL，分別用 0.05、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25 J/cm劑量的UV射線照射“玉皇”下胚軸原生質(zhì)體，然后分別用 10、20、30、40、50、60 μg/mL的羅丹明（R-6G）處理“優(yōu)秀”下胚軸原生質(zhì)體。處理方法參考侯喜林等[13]。

1.2.2 原生質(zhì)體活力測定 伊文思藍(lán)不為活原生質(zhì)體吸收，而為死原生質(zhì)體吸收，顯藍(lán)色的原生質(zhì)體為無活力的。取0.5 mL純化的原生質(zhì)體，加入1～2滴0.3%的伊文思藍(lán)染色液，染色2～3 min后，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)其存活率。重復(fù)3次，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

存活率=（未染色的原生質(zhì)體/觀察的原生質(zhì)體總數(shù)）×100%

1.2.3 原生質(zhì)體的融合及培養(yǎng) （1）正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基激素水平：選用6-BA、NAA、2，4-D激素濃度3個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化原生質(zhì)體培養(yǎng)基激素水平（表1）。

（2）供、受體原生質(zhì)體融合：將經(jīng)過處理的供、受體原生質(zhì)體，按1：1的比例混合（各約0.5 mL）。融合方法采用聚乙二醇（PEG）融合法[14]，略作修改。加入PEG溶液0.425 mL（PEG-6000 250 g/L、Ca－Cl2·2H2O 1.025 g/L、甘露醇 45.5 g/L、山梨醇 45.5 g/L，pH 6.0）。然后再加入15%二甲基亞砜（DMSO）0.075 mL，室溫下靜置融合10 min。加入PEG洗液（PEG洗液A：甘氨酸7.5 g/L，pH 10.5；PEG洗液B：CaCl2·2H2O 14.7 g/L、甘露醇 91 g/L、山梨醇 91 g/L，pH 10.5），PEG 洗液 A、B 使用前按 1∶1 立即混勻。置30℃培養(yǎng)箱靜置30 min，然后小心移除上清，加入 50 mmol/L CaCl2·2H2O，再次清洗 PEG，移除上清，用培養(yǎng)基（PJ1）清洗1次，最后每個(gè)培養(yǎng)皿加入2 mL（PJ1）進(jìn)行融合原生質(zhì)體的培養(yǎng)。

表1 原生質(zhì)體培養(yǎng)基因素水平 （mg/L）

（3）融合體培養(yǎng)：25℃暗培養(yǎng)5～7 d，當(dāng)觀察到好的細(xì)胞分裂時(shí)，加入 0.5 mL 培養(yǎng)基（PJ2），3～5 d后，當(dāng)觀察到有小細(xì)胞團(tuán)形成時(shí)，再加入0.5 mL培養(yǎng)基（PJ3），同時(shí)光照轉(zhuǎn)為正常光照。此后每隔3 d加入1次培養(yǎng)基（PJ3），促使愈傷組織形成。同時(shí)以相同激素水平的培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)UV處理過的“玉皇”原生質(zhì)體，和經(jīng)R-6G處理過的“優(yōu)秀”原生質(zhì)體作為對照。

1.2.4 愈傷組織分化與植株再生 當(dāng)愈傷組織長到約5 mm大小時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增培養(yǎng)基（PJ4），弱散射光下培養(yǎng)，促進(jìn)芽生長。當(dāng)幼苗的真葉形成時(shí)轉(zhuǎn)移到無激素MS培養(yǎng)基中使再生植株正常生長。培養(yǎng)20 d左右，將正常生長植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（PJ5）。原生質(zhì)體培養(yǎng)、稀釋、擴(kuò)增和生根培養(yǎng)基的激素配比見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV射線對“玉皇”原生質(zhì)體核失活的影響

從圖1中可以看出，所有UV射線都會(huì)使原生質(zhì)體的活力下降，并隨著輻射劑量的加大，活力下降增多。與對照相比，除0.050 J/cm的處理外，其他處理劑量，原生質(zhì)體活力下降都超過了50%，說明青花菜原生質(zhì)體對UV射線處理較為敏感。對上述所設(shè)UV射線劑量處理的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后，0.050～0.075 J/cm輻射的處理，原生質(zhì)體均在培養(yǎng)中有細(xì)胞分裂，3～5 d開始第一次細(xì)胞分裂，培養(yǎng)13 d左右，倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)25 d左右可以發(fā)現(xiàn)肉眼可見愈傷組織或胚狀體，但隨著輻射劑量的加大，植板率明顯下降。輻射劑量為0.15 J/cm，僅在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)幾次細(xì)胞分裂，未見有細(xì)胞團(tuán)形成。高于0.15 J/cm輻射處理的均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂以及細(xì)胞團(tuán)和胚狀體的形成，試驗(yàn)采用劑量為0.10 J/cm。

表2 培養(yǎng)基的激素配比

圖1 UV射線對受體原生質(zhì)體活力的影響

2.2 羅丹明（R-6G）對“優(yōu)秀”原生質(zhì)體失活的影響

如圖2所示，羅丹明（R-6G）在10 μg/mL濃度下處理30 min（包括離心所用時(shí)間，25℃），“優(yōu)秀”原生質(zhì)體的植板率為14.6%；當(dāng)濃度加倍為20 μg/mL時(shí)，植版率下降為6.7%；當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，植板率為0。試驗(yàn)采用濃度為40 μg/mL，處理30 min。

圖2 羅丹明（R-6G）對受體原生質(zhì)體活力的影響

2.3 融合方法對原生質(zhì)體融合率的影響

對比了姜淑慧等[14]（方法1）、Ryshka[15]（方法2）以及兩種方法結(jié)和（方法3）對融合率的影響。方法1、2、3原生質(zhì)體的融合率分別為 9%、12%、14%，方法3的融合效果要高于方法1和方法2。方法3的洗滌液中，不僅有Ca2+能夠保證原生質(zhì)體的質(zhì)膜穩(wěn)定，而且添加甘露醇能夠保證穩(wěn)定的原生質(zhì)體滲透壓。30℃培養(yǎng)箱中洗滌30 min，可以使原生質(zhì)體膜融合更加充分。

2.4 不同激素組合對青花菜下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

采用正交試驗(yàn)，研究了不同激素組合對青花菜下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響，結(jié)果如表3所示。對9個(gè)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較可以看出，組合4分裂頻率最高，為 18.9%，為 A2、B1、C2。從表 3 中可以看出，極差值RA＞RC＞RB，說明6-BA激素水平變化對分裂頻率的影響高于NAA、2，4-D。

表3 激素組合對原生質(zhì)體分裂頻率的影響

2.5 不同培養(yǎng)基對融合原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

利用Km8p[16]改良的B5[17]以及筆者綜合改良的培養(yǎng)基（PJ），3種培養(yǎng)基進(jìn)行融合體培養(yǎng)的比較。結(jié)果表明同一激素水平下，筆者所采用的培養(yǎng)基融合體分裂頻率相對較高，細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)的時(shí)間相對較早，在進(jìn)一步培養(yǎng)的過程中褐化程度相對較低（表4）。

表4 基本培養(yǎng)基對融合體的影響

2.6 融合體愈傷組織、胚狀體的形成及植株再生

由于供體“玉皇”采用的是正常光照下培養(yǎng)的幼苗下胚軸作為原生質(zhì)體分離材料，“優(yōu)秀”采用的是暗培養(yǎng)的幼苗下胚軸，原生質(zhì)體中不含有葉綠體。通過顯微鏡觀察，結(jié)果如圖3所示。融合體中含有不含葉綠體的融合，圖3A為分離、純化的原生質(zhì)體；圖3B說明供受體之間已發(fā)生融合；在融合體培養(yǎng)3～4 d發(fā)現(xiàn)細(xì)胞第一次分裂，6～7 d第二次分裂，12 d左右就可以觀察到分裂形成的細(xì)胞團(tuán)（圖3C）；18 d左右可以觀察到胚體雛形（圖 3D）；25～30 d形成肉眼可見的愈傷組織或胚狀體（圖3E）；當(dāng)愈傷組織長到約5 mm時(shí)，轉(zhuǎn)移愈傷組織到（PJ4）培養(yǎng)基促進(jìn)芽生長；當(dāng)幼苗的真葉形成時(shí)轉(zhuǎn)移到無激素MS培養(yǎng)基中使再生植株正常生長，再將正常生長植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，促進(jìn)再生植株生根（圖3F、圖 3G）。

圖3 “優(yōu)秀”、“玉皇”原生質(zhì)體融合及再生植株

3 討 論

筆者利用綜合改進(jìn)的PEG融合法將青花菜“玉皇”、“優(yōu)秀”的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，該方法明顯提高了融合率。因?yàn)?種原生質(zhì)體加入PEG融合液后，只發(fā)生粘連，在洗滌過程中才發(fā)生膜融合，核融合通常在第一次有絲分裂過程中發(fā)生[18]，所以在加入PEG溶液使原生質(zhì)體發(fā)生粘連后，洗滌過程才是是否發(fā)生融合的關(guān)鍵。

Km8p、B5是廣泛運(yùn)用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基。近年來，在原生質(zhì)體培養(yǎng)中也有很多在Km8p、B5的基礎(chǔ)上通過改良得來的培養(yǎng)基[19]。筆者結(jié)合了Km8p的有機(jī)成分、B5的礦物質(zhì)鹽，利用甘露醇和山梨醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，以綜合改進(jìn)的培養(yǎng)基進(jìn)行體細(xì)胞融合培養(yǎng)，進(jìn)一步減少了培養(yǎng)過程中的褐化程度，提高分裂頻率。在融合體培養(yǎng)過程中采用不斷減小培養(yǎng)基滲透壓的方法，減少了酚類物質(zhì)對細(xì)胞的毒害作用。供受體材料分別用UV射線和羅丹明（R-6G）進(jìn)行預(yù)處理，但處理劑量及濃度均小于原生質(zhì)體失活的量，因?yàn)樵谔幚磉^程中，細(xì)胞活力均會(huì)受到很大的影響，若均采用鈍化劑量進(jìn)行融合及培養(yǎng)，將會(huì)極大程度降低植板率。經(jīng)過預(yù)處理作為對照培養(yǎng)的供、受體原生質(zhì)體，在培養(yǎng)過程中很少發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞分裂，未見有細(xì)胞團(tuán)形成，繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月以后也未見愈傷組織或胚狀體。由此再次說明，UV射線和羅丹明（R-6G）的處理抑制了供、受體原生質(zhì)體的分裂和生長，融合后培養(yǎng)再生獲得的愈傷組織和胚狀體來源于融合細(xì)胞，再生植株能初步判定為雜種植株。

筆者在建立青花菜原生質(zhì)體融合及培養(yǎng)的新體系的同時(shí)，還探究了原生質(zhì)體融合、培養(yǎng)影響因素，獲得了再生植株，并在原生質(zhì)體融合初期及愈傷組織和胚狀體形成時(shí)期進(jìn)行了初步的雜種鑒定，為進(jìn)一步分子細(xì)胞遺傳研究，生物學(xué)鑒定工作提供了科學(xué)依據(jù)。

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