付廣俊，王敏麗，劉 梅，龍 艷

（安徽農業(yè)大學，安徽 合肥 230036）

山茱萸為茱萸科茱萸屬多年生木本植物，主要以果實入藥，俗稱山茱萸，又名山芋肉、藥棗、實棗兒、棗皮、肉棗等，系名貴大宗藥材[1]。山茱萸其性味酸，澀，微溫，入肝腎兩經，有補益肝腎，澀精固脫之功效，是中醫(yī)臨床中常用的一味藥。山茱萸作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥，具有多種化學成分和藥理作用，故具有廣闊的開發(fā)前景。據(jù)化學分析，山茱萸含有生理活性較強的山茱萸甙、酒石酸、沒食子酸、蘋果酸、樹酯、鞣質和多種維生素等有效成分，具有抗菌消炎，降血脂，降血糖，抗癌，抗衰老，提高免疫力等作用[2-4]。

為了充分有效地利用山茱萸資源，筆者以山茱萸葉片、莖段、種子胚等作為外植體進行了誘導試驗，篩選出生長迅速且質地疏松的誘導愈傷組織，并進行了繼代培養(yǎng)過程中優(yōu)化試驗條件，旨在獲得最佳的繼代培養(yǎng)方法，為山茱萸的細胞懸浮培養(yǎng)，提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為山茱萸的幼嫩葉片、莖段、種子、成熟葉片等，采自于安徽省池州市石臺縣山茱萸生產基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒處理 選取無病蟲害山茱萸的嫩葉、莖段和莖尖作為外植體進行組織培養(yǎng)，先用洗滌劑洗去表面灰塵，再用流水沖洗2 h。清洗后的材料在無菌的條件下，用0.1%HgCl2結合使用75%酒精進行不同時間的消毒處理[5]。放入75%酒精中消毒10~20 s，無菌水沖洗2~3遍，再放入0.1%HgCl2中消毒7~9 min，用無菌水沖洗5~6次。滅菌紙吸干水后接種在各種培養(yǎng)基上。種子先用75%酒精浸泡1 min，用0.1%HgCl2消毒5~6 min，再用無菌水沖洗3遍，切取種子中的胚接入無菌培養(yǎng)基上[6]，觀察并記錄培養(yǎng)狀況。

1.2.2 培養(yǎng)條件 以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂 7 g/L，pH 值為 5.6～6.0，以及不同濃度的激素 2，4-D，KT。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為2 000～3 000 lx，光照時間12 h/d 。

1.2.3 愈傷組織的誘導 將消毒處理后的無菌幼嫩葉片、老葉片、莖段作為外植體，其中葉片切成0.4 cm×0.4 cm的小塊、莖段切成1 cm左右的小段，然后將不同的外植體接種于MS+2，4-D（1 mg/L）+KT（3 mg/L）培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導研究。每個處理20塊左右，重復3次，25 d后進行繼代培養(yǎng)。1.2.4 愈傷組織繼代培養(yǎng) 選擇質地均勻疏松度好的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，把愈傷組織接種于不同條件的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)一般5次以上，即可得到均勻、疏松、狀態(tài)穩(wěn)定的愈傷組織。每瓶愈傷組織接種量1 g左右，每組處理15瓶，重復3次。觀察愈傷組織的生長狀態(tài)、顏色以及疏松度等狀況，計算其生長率。

1.2.5 誘導、繼代培養(yǎng)考核指標 生長率（%）=（收獲細胞量-接種細胞量）/接種細胞量×100%；死亡率（%）=（死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100% ；污染率（%）=（污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；愈傷組織誘導率（%）=（形成愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

2 結果與分析

2.1 山茱萸愈傷組織的誘導

2.1.1 不同激素濃度對山茱萸外植體的誘導效應將山茱萸嫩葉、老葉、莖段、無菌苗等接種到添加了不同組合濃度的KT+2，4-D的MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導，接種外植體個數(shù)均為60，結果如表1所示。

表1 不同KT+2，4-D濃度對山茱萸葉片、莖段、無菌苗愈傷組織誘導率的影響

KT+2，4-D的組合均可以不同程度地誘導愈傷組織形成，KT（3 mg/L）+2，4-D（1 mg/L）組合對山茱萸的誘導效果最好，最高誘導率達80%以上。如圖1所示，嫩葉片產生的愈傷組織較疏松，顏色淺，不易分化，這種愈傷組織在培養(yǎng)過程中，要及時進行繼代培養(yǎng)，否則容易轉變成灰褐色，產生褐變，直至死亡；莖段產生的愈傷組織一般比較堅實致密，繼代培養(yǎng)過程中，顏色逐漸變?yōu)榘咨Y構堅實緊密，不易褐變；老葉片愈傷組織顏色呈淺黃色，結構堅實緊密，易褐變；無菌苗葉片愈傷組織顏色呈淡黃色，愈傷組織疏松易碎，繼代培養(yǎng)中易褐變。無菌苗與老葉片不適合做繼代培養(yǎng)，嫩葉片和莖段的愈傷組織都適合繼代培養(yǎng)。

圖1 山茱萸愈傷組織

2.1.2 消毒處理對外植體的污染控制比較 污染是指在組織培養(yǎng)過程中由于微生物的存在，使培養(yǎng)物生長受到影響或死亡的現(xiàn)象，所以控制污染是組培中的首要技術[7]。植物本身帶菌是造成組織污染的關鍵因素，山茱萸外植體所帶菌不易清涂，對山茱萸初代培養(yǎng)的影響巨大。采用0.1%的HgCl2和75%的酒精聯(lián)合消毒，比較了不同消毒時間對污染控制的影響，接種數(shù)均為30，結果如表2所示。

表2 消毒處理對山茱萸不同外植體消毒效果的影響

由表2可知：接種1周后觀察發(fā)現(xiàn)，以0.1%HgCl2消毒5 min的材料污染情況很嚴重，以75%乙醇消毒10 s和0.1%HgCl2消毒7 min時，材料污染較小。 將75%乙醇、0.1%HgCl2的消毒時間延長時，污染率顯著下降，當以75%乙醇消毒20 s和0.1%HgCl2消毒11 min時，污染率變?yōu)?。但隨著殺毒時間的延長，材料的死亡率大幅提高。綜合考慮以上因素，認為0.1%HgCl2消毒9 min和75%乙醇消毒15 s為較理想的消毒處理時間，經過消毒處理，培養(yǎng)過程中褐化程度、污染率以及死亡率都較低，生長狀態(tài)良好。

2.1.3 光照條件對山茱萸葉片形成愈傷組織的影響 在相同的培養(yǎng)基中，不同光照條件下的愈傷組織誘導率、愈傷組織的性狀都有明顯的差異。以山茱萸葉片為外植體，接種于誘導培養(yǎng)基中，將其中的一部分置于光照下（光照時間為12 h/d），而將另一部分放在黑暗中培養(yǎng)，接種外植體數(shù)均為30，接種第25天后其愈傷組織的生長情況如表3所示。

表3 光照條件對山茱萸葉片形成愈傷組織的影響

愈傷組織好的標準是生長快，顏色淺，愈傷疏松易生長，不易褐變。從表3可以看出，光照條件對山茱萸葉片愈傷組織形成的遲早、性狀和出愈率等方面有很大的影響。據(jù)試驗觀察，暗培養(yǎng)下外植體黃化嚴重，葉片易褐變，愈傷組織生長速度慢，性狀一般。在光照培養(yǎng)下的愈傷組織顏色為淺白色，生長快，高度分散，性狀好。因此，光照培養(yǎng)更有利于山茱萸疏松愈傷組織的誘導。

2.2 山茱萸愈傷組織的繼代培養(yǎng)

2.2.1 接種量對愈傷組織生長的影響 在其他條件不變的情況下，選擇不同接種量的愈傷組織進行培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)后愈傷組織的生長率來確定最佳的接種量。當平均接種量分別為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/瓶時，接種20 d后的平均重量分別為0.95、1.29、1.65、1.96、2.19 g/瓶，平均生長率分別為 58.3%、61.3%、65.0%、63.3%、56.4%。由此可見，接種量過大或過小都不利于愈傷組織的生長。當接種量為1.0 g/瓶時，愈傷組織平均生長率最高。接種量過大時，重量增加但生長率反而減少，這是由于部分細胞吸收不到營養(yǎng)，培養(yǎng)后期愈傷組織易老化褐變所致。因此，愈傷組織的適宜接種量在1.0 g/瓶左右。

2.2.2 不同pH值對愈傷組織繼代生長的影響在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，選擇不同pH值的培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，根據(jù)接種20 d后的重量來選擇最適pH值。當pH值分別為5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，接種量為1.0 g/瓶，接種20 d后的重量分別為1.18、1.45、1.76、1.48、1.31 g/瓶。研究結果表明：初始pH值偏高或偏低都不利于愈傷組織的生長。當pH值小于5.6時，培養(yǎng)基無法很好的凝固，水分含量大，接入的愈傷組織生長緩慢，容易褐變死亡。當pH值大于6.0時，培養(yǎng)基較硬，接入的愈傷組織很難固定，容易松動，難以從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)，這樣也會造成愈傷組織生長緩慢，愈傷組織缺乏營養(yǎng)，顏色逐漸變黃，甚至褐變死亡。當pH值為5.6～6.0時，以pH 5.8為最佳，培養(yǎng)基軟硬適中、質地良好，接種愈傷組織生長狀態(tài)好，易得到疏松而生長旺盛的愈傷組織。

2.2.3 光照條件對愈傷組織生長狀況的影響 以山茱萸葉片誘導產生的結構狀態(tài)較為一致的疏松愈傷組織為材料，一組在12 h/d的光照條件下進行培養(yǎng)；另一組于25℃條件下進行暗培養(yǎng)。當接種天數(shù)分別為 1、5、10、15、20、25、30、35 d 時，光照條件下山茱萸愈傷組織的重量分別為0.60、0.64、0.73、0.85、0.95、1.02、1.06、1.03 g/瓶，暗培養(yǎng)條件下山茱萸愈傷組織的重量分別為 0.60、0.62、0.68、0.77、0.86、0.92、0.89、0.82 g/瓶。山茱萸愈傷組織在光照條件下，35 d后進入衰亡期，而在黑暗中30 d后就進入了衰亡期。觀察細胞的狀態(tài)后發(fā)現(xiàn)，光照下產生的愈傷組織隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞的顏色變化不大，生長狀態(tài)也較好，而暗培養(yǎng)下的愈傷組織太疏松，時間稍長，褐變情況越來越嚴重。在光照條件下不同時間的生長量都要大于在黑暗條件下的生長量。由此可見，光照條件有利于愈傷組織的生長。

3 結論

研究分別選擇了嫩葉、老葉、莖段、無菌苗作為外植體進行愈傷組織誘導，通過比較發(fā)現(xiàn)嫩葉、莖段、無菌苗都是較適宜的培養(yǎng)材料，其中以嫩葉、莖段為外植體誘導愈傷組織的形成，誘導率可達80%以上，愈傷形成的時間也相對較短；而以老葉為外植體，誘導率最差，只有40%左右，形成愈傷組織時擇在光照強度1 500～2 000 lx，3%蔗糖，pH值為5.8左右時對嫩葉進行愈傷組織誘導，誘導效果最好。繼代培養(yǎng)以pH值為5.8，接種量1g/瓶，在12 h/d的光照條件下進行培養(yǎng)，獲得的愈傷組織最適宜做懸浮培養(yǎng)。

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