馮小強(qiáng)，李小芳，楊 聲，于芳琴

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001；2.定西師范高等專科學(xué)校，甘肅 定西 743000）

許多現(xiàn)代文明病與人體缺乏抗氧化營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，而補(bǔ)充抗氧化營養(yǎng)物質(zhì)則有助于對(duì)這些疾病的預(yù)防治療。因此尋找天然、安全、有效的抗氧化劑資源尤為重要。柑桔類水果所含有的人體保健物質(zhì)，主要有類黃酮、單萜、香豆素、類胡蘿卜素、類丙醇、吖啶酮、甘油糖脂質(zhì)等。桔皮的主要成分是纖維素，富含檸檬苦素，能有效抑制癌細(xì)胞的生長。桔皮膳食纖維具有多種生理功能，其中清除自由基作用越來越受到研究者的關(guān)注。對(duì)于桔皮抗氧化活性的研究有所報(bào)道[1-6]，但是，桔皮中黃酮類物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化以及對(duì)桔皮、桔絡(luò)、桔籽中黃酮含量和抗氧化活性的差異研究還未見報(bào)道。本文研究了桔皮黃酮類物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化，并對(duì)桔皮、桔籽、桔絡(luò)中黃酮含量和抗氧化活性進(jìn)行了比較，該研究為進(jìn)一步有效利用這一寶貴的植物資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮桔子購于天水師范學(xué)院華嶸超市，桔皮、桔籽、桔絡(luò)在60℃烘干恒重并粉碎備用。721分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 提取工藝優(yōu)化

考察提取溶劑A（60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇），提取時(shí)間 B（1.5 h，2 h，2.5 h），提取溫度 C（60℃，70℃，80℃），固液比 D（1∶10，1∶15，1∶20）等因素對(duì)黃酮類化合物提取效果的影響，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

稱取桔皮粉9份，依次為6.087 5、6.074 1、6.073 2、6.022 4、6.046 4、6.006 2、6.002 5、6.022 1、6.006 2 g，放入三口燒瓶中，依次加入60%、70%、80%的乙醇，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，回流提取兩次，提取液抽濾后濃縮，轉(zhuǎn)移到9個(gè)小錐形瓶中備用。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取29.6 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶解，稀釋至刻度即得0.296 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 1＃、2＃、3＃、4＃各0.25 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.15 mL搖勻，放置6 min，在各加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL，用95%乙醇稀釋至刻度至10 mL，搖勻放置15 min，在510 nm測定吸光度值A(chǔ)（g），以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.4 總黃酮含量的測定

取0.25 mL桔皮提取液置于10 mL的試管中，各加入5%硝酸鈉溶液0.15 mL搖勻，放置6 min，再加入10%的硝酸鋁溶液各0.15 mL，搖勻，放置6 min，再加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL，用無水乙醇稀釋至刻度10 mL，搖勻放置15 min，在510 nm測定吸光度A[7]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出樣品中總黃酮的含量（以蘆丁計(jì)），桔皮總黃酮的提取率計(jì)算如下：

提取率（%）=100×總黃酮的質(zhì)量（以蘆丁計(jì)）／桔皮粉的質(zhì)量（干重）

1.5 對(duì)O2－·自由基的清除作用

取0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl緩沖液4.6 mL置于試管中，于25℃水浴預(yù)熱20 min，加不同濃度供試液1.0 mL，10 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混勻，于25℃水浴4 min，加8 mmol/L HCl 0.1 mL終止反應(yīng)，以pH=8.2的Tris-HCl緩沖液調(diào)零。在325 nm處測定吸光度Ax，模型對(duì)照組（A0）用溶劑代替供試液，考慮供試液本身的吸光度值，用溶劑代替鄰苯三酚溶液作為樣品對(duì)照組（Ay），每個(gè)濃度組平行測定3次，求其平均值，加樣如表1所示。測定結(jié)果以清除率表示，計(jì)算公式：

清除率（%）=100×[A0－（Ax－AY）]/A0

1.6 對(duì)OH·的清除能力

清除羥自由基的能力是體外常用的評(píng)估抗氧化方法之一。試驗(yàn)采用了水楊酸捕獲法，利用fenton體系產(chǎn)生羥自由基，加入水楊酸捕獲，能在510 nm產(chǎn)生強(qiáng)吸收的有色物質(zhì)，通過測定其吸光度來判斷。取2 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，6 mmol/L過氧化氫1 mL，6 mmol/L水楊酸1 mL，加入樣品1 mL，靜置30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測定吸光度，計(jì)算羥自由基的清除率。

清除率（%）＝100×[A0－（AX－AY）]/A0

式中：A0為以溶劑代替供試液的試劑空白管的吸光度；Ax為加了供試劑的吸光度，Ay為不加顯色劑的供試液的本底光密度，是為了消除供試液本身顏色對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.7 還原能力測定

還原能力的強(qiáng)弱可以反映藥物的潛在抗氧化性能，是體外抗氧化的一個(gè)重要指標(biāo)，本試驗(yàn)用的是鐵氰化鉀法。取2 mL的樣品，加入2 mL的磷酸緩沖液（pH=6.6）和1%鐵氰化鉀溶液2 mL混勻，在50℃下保溫20 min，加入10%的三氯乙酸溶液2 mL，震蕩搖勻后取2 mL的混合液，加入2 mL去離子水和0.1%的三氯化鐵溶液0.4 mL，靜置10 min。用去離子水為空白，在700 nm下進(jìn)行比色，吸光度的值越大說明還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表1中可以看出4個(gè)因素對(duì)浸提效果的影響。由極差分析可知，各因素對(duì)桔皮總黃酮提取率的影響順序是：B>D>C>A，即回流時(shí)間>固液比>回流溫度>乙醇濃度，回流時(shí)間對(duì)黃酮的提提取效果的影響達(dá)到顯著的水平，RB=0.059 3，表示提取時(shí)間為1.5 h與2.5 h相比，提取結(jié)果要提高0.059 3。固液比對(duì)黃酮提取效果的影響也較大，RD=0.040 2，表示固液比1∶10與1∶15相比，提取效果提高0.040 2。本試驗(yàn)確定的較適提取組合為A1B1C1D1，即桔皮黃酮浸提法最佳提取條件為60%乙醇為提取溶劑，在60℃，固液比1∶10的條件下提取1.5 h，在上述工藝條件下黃酮得率為0.175 8%。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2 桔皮、桔籽、桔絡(luò)中黃酮含量

以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值（OD）為縱坐標(biāo)，得到線性方程為y=3.976 8 x－0.000 3，R2=0.999 9的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該線性方程測得樣品的吸光度，計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。桔籽、桔絡(luò)的粉末質(zhì)量分別為6.073 1 g和5.924 5 g，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，桔籽、桔絡(luò)的吸光值分別為0.30和0.66，濃度分別為0.754 4 mg/mL和1.609 4 mg/mL，計(jì)算出桔籽、桔絡(luò)提取液中黃酮的含量分別為0.47%和0.97%。桔皮、桔籽、桔絡(luò)中的黃酮含量分析發(fā)現(xiàn)，桔絡(luò)的黃酮含量最高達(dá)0.97%，桔籽的次之，黃酮含量0.47%，桔皮中黃酮含量最低為0.18%。

2.3 對(duì)O2－·的清除作用

模型對(duì)照組的吸光度的值A(chǔ)0為0.394，不同濃度桔皮、桔絡(luò)、桔籽提取液吸光值及對(duì)O2－·的清除率見表2。桔皮、桔絡(luò)、桔籽中黃酮對(duì)O2－·的清除能力依次增強(qiáng)，且隨著濃度的依次減小，桔絡(luò)、桔皮、桔籽中黃酮對(duì)O2－·的清除能力依次減弱。

表2 不同濃度桔皮、桔絡(luò)、桔籽提取液吸光值及對(duì)O2-·的清除率

2.4 對(duì)OH·的清除能力

模型對(duì)照組的吸光度的值A(chǔ)0為0.390，不同濃度桔皮、桔絡(luò)、桔籽提取液吸光值及對(duì)OH·的清除率見表3。桔籽對(duì)OH·的清除能力最強(qiáng)，桔皮次之，桔絡(luò)最弱，并且隨著濃度的依次減小，桔皮、桔絡(luò)和桔籽中黃酮的清除能力依次減弱。

表3 不同濃度桔皮、桔絡(luò)、桔籽提取液吸光值及對(duì)OH·的清除率

2.5 還原力測定

不同濃度桔皮、桔絡(luò)、桔籽提取液在700 nm的吸光值如圖1所示。桔皮提取物的還原力最強(qiáng)，桔籽提取物次之，桔絡(luò)提取物最弱，并且隨著提取物濃度的減小，桔皮、桔籽、桔絡(luò)提取物的還原力也依次減弱。

圖1 不同濃度桔皮、桔絡(luò)、桔籽提取液的吸光值

3 結(jié)論

（1）桔皮中黃酮化合物的最佳提取工藝條件是添加 60%乙醇，固液比 1∶10，60℃提取 1.5 h，黃酮得率達(dá)0.175 8%，桔絡(luò)、桔籽、桔皮中黃酮含量依次降低。

（2）桔籽、桔絡(luò)、桔皮中黃酮對(duì) O2－·清除作用依次減弱；桔籽、桔皮、桔絡(luò)中黃酮對(duì)OH·清除能力依次減弱，桔皮中黃酮與桔籽、桔絡(luò)中黃酮之間形成明顯差異；桔皮、桔籽、桔絡(luò)黃酮還原力依次減弱。

[1]張曉娟，祝 鈞.橙皮、柚皮、桔皮抗氧化活性物質(zhì)的提取與保存條件優(yōu)化 [J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，28（3）：44-47.

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