龔震宇,童亞林△,萬友華,楊潤生,蘇曉玲
(中國人民解放軍第181醫(yī)院:1.燒傷整形科;2.病理科;3.動物實驗中心,廣西桂林541002)
燒傷患者合并糖尿病在臨床中較常見,這類患者的創(chuàng)面愈合較困難,常發(fā)展成經(jīng)久不愈的潰瘍,極大地影響了臨床治療效果[1]。康膚霜為燒傷創(chuàng)面外用藥物,動物實驗證實其對急、慢性創(chuàng)面的愈合具有明顯促進作用[2-4]。本實驗在已建立的新型糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面模型的基礎上,觀察康膚霜對該模型創(chuàng)面愈合的影響。
1.1 材料
1.1.1 動物 健康的無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級 Wistar雄性大鼠24只,體質(zhì)量(220±25)g,由桂林醫(yī)學院動物中心提供(合格證號:SCXK桂2007-0001)。本實驗經(jīng)解放軍第181醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準。
1.1.2 主要試劑及藥物 重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)凝膠購自桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司(批號:20060601);聚維酮碘為長沙雨花消毒藥有限公司產(chǎn)品(批號:20070727/59);四氧嘧啶為美國Sigma公司產(chǎn)品(批號:GA-14908);增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(streptavidin biotin-peroxidase complex,SABC)免疫組織化學染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(克隆編號PC10)??的w霜為鋅、冰片、洗必泰、水溶性基質(zhì)、少量維生素A及維生素E按一定比例配制的水包油型白色霜劑,由解放軍第181醫(yī)院自行研制。
1.1.3 儀器 主要儀器包括:One Touch血糖儀(美國強生公司)、Olympus BX51型光學顯微鏡(日本Olympus公司)、DP-70圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)、自動控時調(diào)壓燙傷儀(解放軍第181醫(yī)院研制,發(fā)明專利號200610114104.4)。
1.2 實驗方法
1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 實驗前大鼠禁食12h,測血糖,選取空腹血糖低于7.0mmol/L的大鼠,尾靜脈注射四氧嘧啶溶液(40mg/kg),注射后自由飲食,1周后測隨機血糖,若血糖超過11.1mmol/L,持續(xù)4周,并伴有體質(zhì)量減輕,多飲、多食、多尿,即可認為建模成功[5]。
1.2.2 糖尿病大鼠燙傷模型的建立[6]取成功建模的糖尿病大鼠24只,采用10%硫化鈉水溶液于大鼠背部脫毛,24h后確認脫毛區(qū)無損傷。采用1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)大鼠腹腔注射,麻醉成功后,在大鼠背部脊柱兩側標出4個直徑為1.5cm的圓形區(qū)域(左、右側各2個,前后創(chuàng)面相距4cm)。采用自動控時調(diào)壓燙傷儀致傷,設定高壓鍋內(nèi)壓力為300mmHg(0.04kPa),溫度為106℃,燙傷時間為2s,致傷后創(chuàng)面皮膚顏色呈灰白,質(zhì)地均勻一致,病理組織學檢查證實為深Ⅱ度。
1.2.3 實驗分組 致傷后,將大鼠的4個創(chuàng)面隨機分為康膚霜組、rhEGF組、聚維酮碘組及生理鹽水組,致傷后分別采用康膚霜、rhEGF、聚維酮碘及生理鹽水外敷,藥物完全覆蓋創(chuàng)面,用無菌紗布覆蓋、包扎,膠布固定,每日換藥1次至創(chuàng)面愈合。實驗期間單籠、正常喂養(yǎng)。
1.2.4 實驗觀察 (1)創(chuàng)面大體觀察。每日換藥時肉眼觀察創(chuàng)面情況,包括:創(chuàng)面水腫滲出程度、是否干燥、有無分泌物及創(chuàng)周紅腫變化等,如發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面有異常分泌物,需進行分泌物細菌培養(yǎng)。(2)創(chuàng)面愈合時間。觀察創(chuàng)面上皮完全愈合所需時間,由2位實驗人員分別判定并記錄。(3)創(chuàng)面愈合率。燙傷后第7、14、21天用數(shù)碼相機對傷口進行照相,采用Image Pro Plus(IPP)V6.0圖像分析軟件計算創(chuàng)面愈合面積。按照公式計算創(chuàng)面愈合率[7]:創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-當前創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。(4)病理學及組織學觀察。燙傷后第7、14、21天各處死6只大鼠,取創(chuàng)面組織行4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟切片,蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,光鏡下觀察創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤、新生血管形成以及肉芽組織與再上皮化變化的情況。(5)PCNA檢測。采用SABC試劑盒,染色步驟按試劑盒說明書進行,以磷酸鹽緩沖溶液代替第一抗體作為陰性對照,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色,細胞核呈棕色者為陽性。采用計數(shù)PCNA 標 記指數(shù)(labeling index,LI)方法[8],在400倍光鏡下觀察染色結果,每組選取6個視野,每個視野均觀察100個細胞,計算陽性細胞數(shù),即為標記指數(shù)。
1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量數(shù)據(jù)用±s表示,創(chuàng)面愈合時間差異用單向方差分析;創(chuàng)面愈合率差異用重復測量方差分析;PCNA標記指數(shù)數(shù)據(jù)用析因分析,采用最小顯著差數(shù)法(the least significant difference,LSD)進行兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 創(chuàng)面大體觀察 燙傷后見創(chuàng)面呈灰白色,創(chuàng)面中心與周邊色澤均勻、質(zhì)地一致,與周圍正常組織界限明顯。換藥后1~4d,rhEGF組及生理鹽水組創(chuàng)面腫脹、滲出最為明顯,聚維酮碘組次之,康膚霜組最輕。隨著換藥時間延長,創(chuàng)面逐漸好轉至完全愈合,4組創(chuàng)面均未出現(xiàn)明顯膿性分泌物,細菌培養(yǎng)均為陰性,見圖1~3。
圖1 燙傷時各組創(chuàng)面大體觀察
圖2 燙傷后第3天各組創(chuàng)面大體觀察
圖3 燙傷后第21天各組創(chuàng)面大體觀察
2.2 創(chuàng)面愈合時間 4組大鼠創(chuàng)面愈合時間由長到短分別為:生理鹽水組[(26.37±1.0)d]、聚維酮碘組[(23.83±0.75)d]、rhEGF組[(22.33±1.03)d]及康膚霜組[(20.67±1.03)d]。4組大鼠創(chuàng)面愈合時間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=36.86,P<0.05)。
2.3 創(chuàng)面愈合率 燙傷后第7、14、21天創(chuàng)面愈合率統(tǒng)計結果顯示:康膚霜組大鼠創(chuàng)面的愈合率高于其余3組,4組大鼠創(chuàng)面愈合率兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=1239.09,P<0.05)。各組創(chuàng)面愈合率隨時間推移明顯升高(P<0.05),3個時間點的大鼠創(chuàng)面愈合率兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
2.4 病理學及組織學觀察 燙傷后第7天康膚霜組光鏡下可見真皮乳頭層充血、水腫不明顯,炎癥細胞浸潤及壞死組織較其他3組少。燙傷后第14天康膚霜組創(chuàng)面的毛細血管數(shù)、毛細血管內(nèi)皮細胞數(shù)及成纖維細胞數(shù)較其他3組多,肉芽組織生長也更旺盛。燙傷后第21天康膚霜組創(chuàng)面上皮化較完全,新生上皮細胞分化較好,新生上皮組織較厚,有較多的表皮釘腳深入真皮層,而其他3組新生上皮組織較薄,未見有表皮釘腳形成。見圖4。
表1 燙傷后不同時間各組創(chuàng)面愈合率的比較±s,%,n=6)
表1 燙傷后不同時間各組創(chuàng)面愈合率的比較±s,%,n=6)
組別燙傷后時間(d)7 14 21生理鹽水組10.83±1.12 43.76±0.70 75.43±0.89聚維酮碘組 16.12±0.40 48.81±0.76 78.65±0.45 rhEGF組 19.80±1.09 61.73±0.79 89.25±0.98康膚霜組20.83±0.78 64.63±1.54 96.37±1.34
圖4 燙傷后第7、14、21天生理鹽水組與康膚霜組創(chuàng)面組織的光鏡觀察(HE×100)
圖5 燙傷后第7、14、21天生理鹽水組與康膚霜組創(chuàng)面組織的PCNA陽性表達(SABC×100)
表2 燙傷后不同時間各組PCNA標記指數(shù)比較±s,%,n=6)
表2 燙傷后不同時間各組PCNA標記指數(shù)比較±s,%,n=6)
組別燙傷后時間(d)7 14 21生理鹽水組14.67±1.86 36.83±2.48 42.17±2.14聚維酮碘組 17.33±1.37 40.83±1.17 46.50±1.87 rhEGF組 28.50±1.05 73.33±2.16 63.33±2.34康膚霜組32.83±1.47 76.33±2.00 67.67±2.94
2.5 PCNA在創(chuàng)面組織中的表達 燙傷后第7、14天4組大鼠創(chuàng)面組織的PCNA主要表達于腺體、毛囊上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞;燙傷后第21天4組大鼠創(chuàng)面組織的PCNA主要表達于新生上皮的基底細胞、基底層以上的部分表皮細胞、腺體和毛囊的上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞。4組大鼠燙傷后第14、21天創(chuàng)面組織均可見少量成纖維細胞PCNA的陽性表達,見圖5??的w霜組PCNA標記指數(shù)高于其他3組,4組大鼠創(chuàng)面組織的PCNA標記指數(shù)兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。標記指數(shù)隨時間推移明顯升高(F=2 174.78,P<0.05);第14、21天與第7天比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),第14天與第21天比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。
實驗先采用尾靜脈注射四氧嘧啶法建立糖尿病大鼠模型,燙傷后4周大鼠一直維持較高的血糖水平,不同的時間點血糖無明顯波動。在此糖尿病大鼠模型上,采用自行研制的自動控時調(diào)壓燙傷儀建立深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面大鼠模型,大體及病理結果證實該模型創(chuàng)面燙傷深度均勻、界限清楚,是一種較理想的糖尿病燙傷創(chuàng)面動物模型。
實驗結果顯示,與其他3組比較,康膚霜組糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的愈合速度最快,創(chuàng)面愈合時間最短,創(chuàng)面愈合率最高,表明康膚霜能促進燙傷創(chuàng)面愈合。病理組織學顯示康膚霜能明顯減輕燙傷創(chuàng)面早期的炎癥反應。rhEGF是促進上皮細胞生長的重要因子之一,動物實驗及臨床試驗顯示其具有加速糖尿病創(chuàng)面愈合的作用[9-10]。本實驗表明康膚霜促進創(chuàng)面愈合的作用優(yōu)于rhEGF。PCNA是增殖細胞核內(nèi)DNA聚合酶δ(DNApolymeraseδ,polδ)的一種輔助因子,與真核細胞S期的DNA的復制有關[11],是反映細胞增殖狀態(tài)的一個重要指標[12-14]。皮膚組織中的PCNA主要定位于表皮基底層細胞、毛囊上皮細胞、內(nèi)皮細胞和部分成纖維細胞的細胞核內(nèi),在皮膚組織的發(fā)生與修復過程中表達增強。實驗結果顯示康膚霜組PCNA標記指數(shù)高于其他3組,說明康膚霜對創(chuàng)面組織細胞的增殖有明顯的促進作用,能加快創(chuàng)面再上皮化,促進創(chuàng)面愈合。
糖尿病創(chuàng)面愈合困難主要與2個環(huán)節(jié)有關:(1)合成分泌膠原的組織細胞功能異常;(2)調(diào)控細胞外基質(zhì)的生長因子及其他調(diào)控因子的功能異常。在創(chuàng)面愈合過程中,這些涉及不同環(huán)節(jié)的功能異常相互作用,構成了創(chuàng)面愈合困難的基礎[15]??的w霜是由鋅、冰片、洗必泰、水溶性基質(zhì)、少量維生素A及維生素E按一定比例配制成的水包油型白色霜劑。維生素A可促膠原蛋白交聯(lián)及組織內(nèi)沉積;加速創(chuàng)面上皮化;增強巨噬細胞吞噬創(chuàng)面壞死組織,釋放細胞生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子及纖維連接蛋白的作用[16]。鋅不僅能夠提高生長激素水平,使后者對胰島素樣生長因子-1誘導作用增強,而且對表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)及其受體的表達有促進作用,從而加速表皮細胞增殖和膠原的沉積,促進創(chuàng)面愈合[17]。維生素E可降低毛細血管通透性,與維生素A都有抗氧化作用[18]??的w霜外敷創(chuàng)面可使局部潮濕、缺氧。潮濕環(huán)境有利于間生態(tài)組織恢復活力。低氧環(huán)境可刺激毛細血管增生,改善局部血液循環(huán);加速壞死組織的溶解;促進多種生長因子的釋放;利于表皮細胞的遷移及間生態(tài)組織恢復活力[19]。但潮濕環(huán)境也利于細菌繁殖,康膚霜成分中的洗必泰、冰片具有抗菌、消炎作用[20-21],結合及時清創(chuàng)與換藥,可避免創(chuàng)面感染,為加速創(chuàng)面修復提供良好的局部環(huán)境。本實驗證實康膚霜具有明顯加快糖尿病燙傷創(chuàng)面愈合的作用,這與康膚霜中多種配方成分的綜合促愈合作用有關,對于其促進糖尿病創(chuàng)面愈合的機制尚需進一步深入研究。
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