王績英，趙雪強(qiáng)，王昌明，莫碧文，蔣 明，陳 峰

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林541001）

在各種常見腫瘤中男性肺癌的發(fā)病率和死亡率最高，女性肺癌的發(fā)病率位居第4，死亡率位居第2。在中國，肺癌的發(fā)病率逐年上升［1］。由于大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，使放、化療成為肺癌綜合治療的主要手段，但大多數(shù)肺癌患者對目前的常規(guī)化療藥物不敏感，因此，迫切需要尋求新的、更有效的化療藥物。腫瘤靶向治療是以腫瘤細(xì)胞的某些關(guān)鍵蛋白作為靶點(diǎn)，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞沒有不良反應(yīng)。在本研究中，將人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞用腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（tumor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）、三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）處理，觀察A549細(xì)胞的增殖與凋亡，以及TRAIL和As2O3對A549細(xì)胞核因子kappa B（nuclear factor－kappa B，NF－κB）、半胱－天冬 氨 酸 蛋 白 酶 （cysteinyl aspartate specific protease，caspase）－3、survivin mRNA 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自行傳代保存。重組人TRAIL為以色列PROSPEC公司產(chǎn)品，As2O3注射液為哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)公司產(chǎn)品，Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)（Dulbecco′s modified Eagle′medium，DMEM）、Trizol、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）System購自TAKARA公司。引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素及100μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)將其分為對照組（僅加入DMEM）及實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為As2O3（1μmol／L組As2O3處理）、TRAIL組（100μg／L TRAIL處理）及聯(lián)合組（1μmol／L As2O3與100μg／L TRAIL聯(lián)合處理）。

表1 PCR引物序列

1.3 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測 將對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔200μL，2 000個(gè)／孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后按上述分組處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對照（僅加培養(yǎng)基）。培養(yǎng)24、48、72h后終止實(shí)驗(yàn)，每孔加5mg／mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）200μL，震蕩5min，使沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀測490nm吸光度（absorbance，A）值。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）＝［（對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）／對照組A值］×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔4×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12h后，用含0.5%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞周期同步化。按上述分組處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞，70%冷乙醇固定，4℃過夜，檢測前用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，加入20μL核糖核酸酶A（RNaseA），37℃孵育30min，避光加碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，冰浴30min，以300目篩網(wǎng)過濾。調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106／mL后以流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)光源為氬離子，激發(fā)波長488nm，用Multicycle DNA分析軟件行細(xì)胞凋亡率測定。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄－PCR（reverse transcriptase－PCR，RT－PCR）檢測各組細(xì)胞于藥物干預(yù)48h后提取總RNA?？俁NA提取按TAKARA公司提供的試劑操作步驟操作。AMV第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增。NF－κB擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性3min后，94℃變性15s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。survivin擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性3min后，94℃變性15s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。caspase－3擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性3min后，94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)分析，計(jì)算相對表達(dá)量（與β－actin的比值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3、TRAIL對A549細(xì)胞增殖的影響 As2O3組、TRAIL組A549細(xì)胞與對照組比較，細(xì)胞增殖的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合組A549細(xì)胞增殖作用明顯強(qiáng)于As2O3組及TRAIL組，且具有時(shí)間依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 As2O3及TRAIL對A549細(xì)胞的增殖抑制作用（±s，%，n＝3）

表2 As2O3及TRAIL對A549細(xì)胞的增殖抑制作用（±s，%，n＝3）

＊：P＜0.05，與As2O3組比較；△：P＜0.05，與TRAIL組比較。

組別細(xì)胞增殖抑制率24h 48h 72h As2O3組4.3±1.4 15.7±2.7 18.1±4.2 TRAIL組 3.8±1.7 12.8±2.0 15.2±4.2聯(lián)合組 12.7±1.3＊△ 27.3±2.5＊△ 42.7±3.5＊△

2.2 As2O3、TRAIL對A549細(xì)胞凋亡的影響 凋亡的細(xì)胞通透性增加，細(xì)胞膜上會出現(xiàn)小漏洞，在洗滌和染色的過程中小片段DNA從細(xì)胞內(nèi)丟失，使凋亡細(xì)胞的DNA含量低于正常細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀DNA直方圖上出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰。聯(lián)合組 A549細(xì)胞的凋亡率為（28.73±1.55）%，而As2O3組和TRAIL組細(xì)胞凋亡率分別為（13.23±1.99）%和（5.92±2.48）%。聯(lián)合組分別與As2O3組和TRAIL組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 As2O3、TRAIL 對 A549 細(xì) 胞 NF－κB、survivin 及caspase－3mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 As2O3、TRAIL對 A549細(xì)胞 NF－κB mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，經(jīng)As2O3、TRAIL處理48h后，各實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞 NF－κB mRNA 的表達(dá)下降，聯(lián)合組細(xì)胞 NF－κB mRNA表達(dá)下降尤為明顯（P＜0.01），見圖1。

圖1 對照組、TRAIL組、As2O3組及聯(lián)合組A549細(xì)胞NF－κB mRNA 的表達(dá)

2.3.2 As2O3、TRAIL對 A549細(xì)胞survivin mRNA 表達(dá)的影響 與對照組比較，經(jīng)As2O3、TRAIL處理48h后，各實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞survivin mRNA的表達(dá)下降，聯(lián)合組細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)下降尤為明顯（P＜0.01），見圖2。

圖2 對照組、TRAIL組、As2O3組及聯(lián)合組A549細(xì)胞survivin mRNA的表達(dá)

2.3.3 As2O3、TRAIL對 A549細(xì)胞caspase－3mRNA表達(dá)的影響 各實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞經(jīng)As2O3、TRAIL處理48h后，與對照組比較，As2O3組A549細(xì)胞caspase－3mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，TRAIL組A549細(xì)胞caspase－3mRNA的表達(dá)沒有明顯變化；與As2O3組和TRAIL組比較，聯(lián)合組A549細(xì)胞caspase－3mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），見圖3。

圖3 對照組、TRAIL組、As2O3組及聯(lián)合組A549細(xì)胞caspase－3mRNA的表達(dá)

3 討 論

TRAIL是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員，TRAIL通過與其受體［死亡受體（death receptor，DR）4、DR5］結(jié)合而啟動死亡途徑，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終激活caspase－3發(fā)生生物效應(yīng)，從而引發(fā)對TRAIL敏感的細(xì)胞大量、快速凋亡，而對機(jī)體正常組織不具有明顯的毒性作用［2］。因此，TRAIL可能是一種很好的腫瘤靶向治療藥物。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，盡管TRAIL具有良好的特異性，仍面臨抗腫瘤藥普遍存在的耐藥性問題，人們發(fā)現(xiàn)大部分肺癌細(xì)胞對TRAIL耐藥，TRAIL的耐藥機(jī)制目前仍不十分清楚［3－4］。作者推測化療藥物與TRAIL聯(lián)用也許可逆轉(zhuǎn)TRAIL的耐藥性。As2O3是傳統(tǒng)中藥砒石的主要成分，是一種劇毒化合物。目前研究發(fā)現(xiàn)As2O3對急性早幼粒細(xì)胞性白血病具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并已在臨床應(yīng)用，同時(shí)，As2O3可逆轉(zhuǎn)部分腫瘤細(xì)胞的耐藥性。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TRAIL組的凋亡率僅有（5.92±2.48）%，而聯(lián)合組的凋亡率為（28.73±1.55）%。

多藥耐藥（mutidrug resistance，MDR）是影響腫瘤化療效果的重要原因。目前MDR的機(jī)制仍不完全清楚，人們認(rèn)為由于 MDR1基因編碼的跨膜 P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）、MRP1基因編碼的跨膜糖蛋白使細(xì)胞內(nèi)的藥物排出或分布異常，使藥物不能在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效濃度［5－6］。但這一機(jī)制還不能完全闡明 MDR。研究表明，MDR與細(xì)胞凋亡有關(guān)。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的較強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，具有調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡作用，Survivin和肺癌的耐藥性與疾病預(yù)后有關(guān)［7－9］。RT－PCR檢測顯示聯(lián)合組A549細(xì)胞survivin mRNA的表達(dá)明顯下降，而caspase－3mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)。

NF－κB具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，它與腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)。NF－κB的持續(xù)激活刺激細(xì)胞生長，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控［10］。但NF－κB的作用卻有爭議，Ehrhardt等［11］認(rèn)為NF－κB在TRAIL凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡。Shetty等［12］則得出相反的結(jié)論，認(rèn)為NF－κB促進(jìn)TRAIL凋亡信號的發(fā)生，并認(rèn)為NF－κB亞單位的種類及數(shù)量是這一作用的關(guān)鍵。有研究證實(shí)Survivin參與了 NF－κB介導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡全過程，存在NF－κB－Survivin途徑［13－15］。

TRAIL與As2O3聯(lián)用對A549細(xì)胞的增殖抑制作用及誘導(dǎo)凋亡作用明顯強(qiáng)于As2O3或TRAIL單獨(dú)應(yīng)用的作用。在聯(lián)合組中可觀察到細(xì)胞NF－κB mRNA的表達(dá)明顯下降，這說明As2O3可能是通過NF－κB通路下調(diào)survivin mRNA，上調(diào)caspase－3mRNA的表達(dá)，從而解除survivin對caspase－3的抑制而逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞對TRAIL的耐藥性。As2O3能否在體內(nèi)增強(qiáng)TRAIL的凋亡誘導(dǎo)作用，還有待進(jìn)一步的研究。

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