孫 強(qiáng)，湯 偉△，汪曉鶯

（1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，江蘇南通226001；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江蘇南通226001）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行情況存在很大差異。據(jù)WHO報(bào)道，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化及原發(fā)性肝細(xì)胞癌［1］。HBV體內(nèi)持續(xù)感染導(dǎo)致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的機(jī)制尚未完全闡明，白細(xì)胞分化抗原 （cluster of differentiation，CD）4陽(yáng)性T細(xì)胞與CHB的關(guān)系引起人們的注意，并發(fā)現(xiàn)輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1／Th2平衡失調(diào)及調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）功能異常可促進(jìn)CHB的發(fā)生、發(fā)展及惡化［2－3］。近年來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)了一群不同于Th1、Th2及Treg的細(xì)胞亞群，它們不表達(dá)白介素（interleukin）－4或干擾素（interferon，IFN）－γ，卻大量分泌IL－17，被命名為 Th17細(xì)胞［4－5］。新近研究報(bào)道，Th17細(xì)胞在感染性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。目前，Th17細(xì)胞是否參與HBV感染后CHB的發(fā)生、發(fā)展，它與肝臟的炎癥損傷是否存在內(nèi)在聯(lián)系等均未見報(bào)道。本研究擬通過(guò)觀察CHB患者外周血Th17細(xì)胞頻率、血清IL－17水平及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，探討Th17與CHB的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇29例南通大學(xué)附屬醫(yī)院感染科門診和住院確診的CHB患者作為CHB組，其中，男17例，女12例；年齡17～56歲，平均37.8歲。診斷參照2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)修定的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均除外其他病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、自身免疫性肝病及遺傳性肝病等，且未經(jīng)任何抗病毒或免疫調(diào)節(jié)藥物治療。另選17例健康體檢者作為對(duì)照組，其中，男10例，女7例；年齡18～51歲，平均32.9歲；均無(wú)肝炎病史，肝炎病原學(xué)血清標(biāo)志物檢測(cè)為陰性，肝功能各項(xiàng)指標(biāo)正常。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑：IL－17A－PE、CD4－PerCPCy5.5抗體及同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)eBioScience公司，佛波醇酯、離子霉素及布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，BFA）購(gòu)自瑞士Alexis公司，F(xiàn)ix＆Perm（Reagent A、Reagent B）為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，IL－17酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司，HBV血清標(biāo)志物ELISA試劑盒購(gòu)自廈門英科新創(chuàng)科技有限公司，HBV核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中山達(dá)安生物技術(shù)有限公司，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒為日本協(xié)和醫(yī)藥株式會(huì)社產(chǎn)品。主要儀器：流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）、Rotor－Gene熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀及7600型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。

1.3 外周血Th17細(xì)胞頻率的檢測(cè) 采集健康人和CHB患者全血100μL（新鮮肝素鈉抗凝），用RPMI 1640培養(yǎng)基100μL稀釋，加入1μg／mL佛波醇酯工作液5μL，50μg／mL離子霉素工作液4μL及0.5mg／mL BFA工作液4μL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h。加入CD4－PerCP－Cy5.5抗體10μL，室溫避光溫育15min。將其分為2管，每管100μL，編號(hào)為a和b。分別加入Fix＆Perm中的Reagent A（即固定液）100μL，室溫、避光溫育15min，分別加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）3mL，離心5min（離心半徑8cm，1 200r／min），棄除上清液。分別加入Fix＆Perm中的Reagent B（即破膜和溶血液）100μL，同時(shí)在a管中加10μL鼠IgG，b管中加入10μL IL－17A－PE，室溫、避光溫育15min。每管加PBS 3mL，離心5min（離心半徑8cm，1 200 r／min），棄除上清液。加入0.5mL PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 血清細(xì)胞因子IL－17水平的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)CHB患者和健康人外周血血清IL－17的水平，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 血清HBV DNA、HBV標(biāo)志物、ALT的檢測(cè) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)患者血清HBV DNA水平；ELISA法檢測(cè)HBV標(biāo)志物；采用速率法檢測(cè)血清ALT（日立7600型全自動(dòng)生化分析儀）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示。組間Th17細(xì)胞頻率、IL－17水平的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；血清ALT水平與Th17細(xì)胞，HBV DNA與Th17細(xì)胞的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血Th17細(xì)胞頻率的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)多色熒光分析法檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞頻率，CHB組患者和對(duì)照組健康體檢者外周血Th17細(xì)胞頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將CHB患者分為 HBV e抗原（HBV e antigen，HBeAg）陽(yáng)性組與HBeAg陰性組，兩組患者外周血Th17細(xì)胞頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。對(duì)照組中1例健康體檢者和CHB組中1例CHB患者外周血Th17細(xì)胞頻率分別為9.20%和12.11%，見圖1、2。

表1 各組人員外周血Th17細(xì)胞頻率、血清IL－17水平的比較（±s）

表1 各組人員外周血Th17細(xì)胞頻率、血清IL－17水平的比較（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

組別 n Th17頻率（%） IL－17（ng／mL）對(duì)照組17 9.18±1.20 4.15±1.59 CHB組 29 11.58±1.85＊ 6.32±2.44＊HBeAg陽(yáng)性組 16 12.17±1.62 6.26±2.68 HBeAg陰性組13 10.85±1.92 6.38±2.20

2.2 外周血中血清IL－17水平的檢測(cè) CHB組患者和對(duì)照組健康體檢者外周血血清IL－17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將CHB患者分為HBeAg陽(yáng)性組與HBeAg陰性組，兩組患者外周血血清IL－17水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。

圖1 對(duì)照組（1例）外周血Th17細(xì)胞頻率

圖2 CHB組（1例）外周血Th17細(xì)胞頻率

2.3 CHB患者Th17細(xì)胞頻率與HBV DNA載量、血清ALT的直線相關(guān)性分析 CHB組患者外周血Th17細(xì)胞頻率與血清ALT水平正相關(guān)（r＝0.582，P＜0.01），而 Th17細(xì)胞頻率與 HBV DNA載量無(wú)明顯相關(guān)性（r＝－0.213，P＞0.05）。

3 討 論

HBV在機(jī)體持續(xù)性感染所致CHB發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明。HBV是一種非細(xì)胞毒性病毒，當(dāng)其進(jìn)入機(jī)體后常可引起一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)，而機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱又與HBV感染所致的不同臨床結(jié)果密切相關(guān)。在這一系列免疫應(yīng)答中，細(xì)胞免疫應(yīng)答是決定HBV感染后疾病轉(zhuǎn)歸的重要因素，不同T細(xì)胞亞群對(duì)病毒抗原的反應(yīng)不同，即對(duì)病情輕重及疾病轉(zhuǎn)歸的影響不同。目前的研究認(rèn)為，HBV造成的肝損害及其轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的細(xì)胞免疫關(guān)系密切，其中T淋巴細(xì)胞作為主要的效應(yīng)細(xì)胞，與病毒的清除和肝細(xì)胞的損傷直接相關(guān)［6］，效應(yīng)CD4＋T細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要成員，并在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。效應(yīng)CD4＋T細(xì)胞只有在應(yīng)答恰當(dāng)時(shí)，才能建立有效的宿主免疫體系并維持免疫記憶。但如果效應(yīng)CD4＋T細(xì)胞失調(diào)，則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥性損傷，如自身免疫疾病和自身炎癥性疾病等。

根據(jù)細(xì)胞的功能，將CD4＋T細(xì)胞分為Th1、Th2細(xì)胞及Treg細(xì)胞3個(gè)亞群［7－8］。最近人們發(fā)現(xiàn)一群不同于Th1、Th2及Treg的細(xì)胞亞群，它們不表達(dá)IL－4或IFN－γ，卻高表達(dá)IL－17，因此，命名為Th17細(xì)胞。Th17細(xì)胞主要通過(guò)其分泌的細(xì)胞因子IL－17A、IL－17F、IL－6、IL－22及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）等發(fā)揮作用，其中最主要的是IL－17A，也稱為IL－17，其受體在體內(nèi)廣泛表達(dá)。IL－17是一種重要的炎癥介質(zhì)，它可通過(guò)誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子，如IL－6、TNF－α及趨化因子等的表達(dá)介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的局部浸潤(rùn)及組織損傷；IL－17也參與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的增殖、成熟及趨化過(guò)程［9］。Th17細(xì)胞在多種疾病中發(fā)揮著重要的效應(yīng)作用。在感染性疾病中，Luzza等［10］發(fā)現(xiàn)胃、十二指腸幽門螺旋桿菌感染后外周血IL－17水平增加；牙周炎也出現(xiàn)血清IL－17表達(dá)水平的升高，這些提示IL－17參與了細(xì)菌感染后的炎癥反應(yīng)［10－11］；在腫瘤方面，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血 Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子IL－23、IL－17明顯高于健康人，且外周血Th17細(xì)胞頻率與胃癌的分期有關(guān)，晚期胃癌患者頻率較高［12］；在自身免疫性疾病中，研究人員發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病患者炎癥急性期的腸黏膜內(nèi)有大量Th17細(xì)胞存在；在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥以及炎癥性疾病中Th17細(xì)胞發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用；同時(shí)Th17細(xì)胞也與自身免疫性血液病如再生障礙性貧血有密切關(guān)系。另外，有研究發(fā)現(xiàn)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者外周血Th17細(xì)胞頻率增加，IL－17、IL－23水平升高，Th17細(xì)胞可能參與不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊和急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)?。?3－16］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)CHB患者外周血Th17細(xì)胞頻率及其分泌的IL－17變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明CHB患者外周血Th17細(xì)胞頻率明顯高于健康人群，同時(shí)CHB患者外周血IL－17水平也明顯高于健康人群，提示CHB患者體內(nèi)存在較多的Th17細(xì)胞及其相關(guān)分泌因子的高表達(dá)。為探討Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在CHB發(fā)病過(guò)程中的作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)CHB患者組外周血血清HBV DNA載量、ALT進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CHB患者組外周血Th17細(xì)胞頻率與血清ALT水平正相關(guān)（P＜0.01），這一現(xiàn)象提示CHB患者Th17細(xì)胞通過(guò)大量分泌IL－17發(fā)揮生物學(xué)作用，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的聚集，加重肝臟損害。而CHB患者外周血Th17細(xì)胞頻率與HBV DNA載量無(wú)明顯相關(guān)性，提示Th17細(xì)胞的多少與病毒含量的直接關(guān)系并不大，但其與病毒感染后引起的免疫反應(yīng)或組織損傷有關(guān)。

綜上所述，本研究初步表明Th17細(xì)胞可能在CHB的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但Th17細(xì)胞的功能、分布特點(diǎn)及其與CHB持續(xù)感染的免疫機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南［S］.中華肝臟病雜志，2005，13（12）：881－891.

［2］ 福軍亮，徐東平，趙平，等.急慢性乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞鑒定與臨床意義分析［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（22）：1522－1525.

［3］ 辛永寧，宣世英，孫櫻.慢性乙型肝炎Th1／Th2細(xì)胞的免疫功能研究進(jìn)展［J］.臨床肝膽病雜志，2005，21（3）：182－184.

［4］ 李佳，陳小平.Th效應(yīng)細(xì)胞家族的新成員——Th17［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2007，23（11）：1048－1051.

［5］ Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17［J］.Nat Immunol，2005，6（11）：1133－1141.

［6］ Rehermann B，Nascimbeni M.Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection［J］.Nat Rev Immunol，2005，5（3）：215－229.

［7］ Murphy KM，Reiner SL.The lineage decisions of helper T cells［J］.Nat Rev Immunol，2002，2（12）：933－944.

［8］ Reiner SL.Development in motion：helper T cells at work［J］.Cell，2007，129（1）：33－36.

［9］ Kolls JK，Lindén A.Interleukin－17family members and inflammation［J］.Immunity，2004，21（4）：467－476.

［10］Luzza F，Parrello T，Monteleone G，et al.Up－regulation of IL－17is associated with bioactive IL－8expression in Helicobacter pylori－infected human gastric mucosa［J］.J Immunol，2000，165（9）：5332－5337.

［11］Johnson RB，Wood N，Serio FG.Interleukin－11and IL－17 and the pathogenesis of periodontal disease［J］.J Periodontol，2004，75（1）：37－43.

［12］Zhang B，Rong G，Wei H，et al.The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，374（3）：533－537.

［13］Chabaud M，Durand JM，Buchs N，et al.Human interleukin－17：A T cell－derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium［J］.Arthritis Rheum，1999，42（5）：963－970.

［14］郭寧紅，石慶之.Th17細(xì)胞與自身免疫性血液病［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（18）：2533－2535.

［15］余嫻，程翔，廖玉華，等.急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者Th17細(xì)胞檢測(cè)及意義［J］.臨床心血管病雜志，2008，24（2）：145－148.

［16］R?hn TA，Jennings GT，Hernandez M，et al.Vaccination against IL－17suppresses autoimmune arthritis and encephalomyelitis［J］.Eur J Immunol，2006，36（11）：2857－2867.