劉惠民，郭梅艷，王彥華，王 蕾，趙琰龍，韓起廷，瞿 峰，王智紅，王秀清

（1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北邯鄲056002；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，河北邯鄲056002；3.河北省邯鄲市中心血站采血科 056002）

癌變是細(xì)胞分化異常與增殖過度的結(jié)果，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變在這一過程中發(fā)揮重要作用。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducers and activators of transcription，STAT）家族的重要成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，介導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，被確認(rèn)為癌基因［1］。目前，國內(nèi)、外學(xué)者就STAT3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)進行了相關(guān)報道［2－4］，但尚缺乏STAT3在食管上皮內(nèi)瘤變演變過程中作用的研究。為此，本研究采用原位雜交技術(shù)和免疫組織化學(xué)法檢測STAT3在食管癌高發(fā)區(qū)食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌患者病變組織中的表達(dá)情況，以探討其在疾病轉(zhuǎn)歸過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2004～2009年的存檔蠟塊中，按病史及病理資料選取食管癌高發(fā)區(qū)（河北省太行山區(qū)）的食管上皮內(nèi)瘤變病例150例（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級各50例）及食管癌100例進行研究，將其中60例接受食管癌切除術(shù)患者食管上、下殘端的正常黏膜組織作為對照。由2位高年資病理醫(yī)師按照WHO標(biāo)準(zhǔn)［5］對全部病例切片進行復(fù)查。

1.2 原位雜交檢測 操作步驟按STAT3原位雜交檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說明書進行，切片常規(guī)脫蠟至水，預(yù)雜交，雜交，二氨基聯(lián)苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色。未采用探針和RNA酶處理的切片作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測 采用鏈霉親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物（streptavidin biotin－peroxidase complex，SABC）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）對全部樣本進行免疫組織化學(xué)染色，實驗步驟按試劑盒說明書進行，將4μm厚的切片常規(guī)脫蠟至水，滴加兔抗人STAT3多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），其稀釋度為1∶80，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。以乳腺癌組織切片作為陽性對照，以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate－buffered saline，PBS）代替第一抗體作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 STAT3mRNA及STAT3蛋白的陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，染色結(jié)果根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞的百分比進行半定量綜合計分。在光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個高倍視野對陽性細(xì)胞進行計數(shù)，取陽性細(xì)胞百分比的平均值進行計分：無陽性細(xì)胞計0分，≤25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%計4分；按多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的著色強度計分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；將陽性細(xì)胞百分比和著色強度的分值相加：0～2分為陰性（－），≥3分為陽性（＋）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗，用Fisher確切概率法及斯皮爾曼等級相關(guān)（Spearman rank correlation）進行統(tǒng)計學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常食管黏膜、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中STAT3 mRNA的表達(dá) STAT3mRNA的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色。STAT3mRNA在正常食管黏膜、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中的陽性表達(dá)率分別為3.33%、53.33%及89.00%。食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中STAT3mRNA的陽性表達(dá)率均明顯高于正常食管黏膜（P＜0.05），食管癌組織中STAT3mRNA的陽性表達(dá)率明顯高于食管上皮內(nèi)瘤變（P＜0.05），見表1。不同程度的食管上皮內(nèi)瘤變病例中，病變組織STAT3mRNA的表達(dá)隨食管上皮內(nèi)瘤變病變程度的加重而增加（P＜0.05），見表2。

表1 STAT3mRNA和STAT3蛋白在正常食管黏膜、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中的表達(dá)

2.2 正常食管黏膜、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中STAT3蛋白的表達(dá) STAT3蛋白的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色。STAT3蛋白在正常食管黏膜、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中的陽性表達(dá)率分別為6.67%、60.67%及94.00%。食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中STAT3蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于正常食管黏膜（P＜0.05），食管癌組織中STAT3蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于食管上皮內(nèi)瘤變（P＜0.05），見表1。不同程度的食管上皮內(nèi)瘤變病例中，病變組織中STAT3蛋白的表達(dá)隨食管上皮內(nèi)瘤變病變程度的加重而增加（P＜0.05），見表2。

表2 STAT3mRNA和STAT3蛋白在不同程度的食管上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)

2.3 正常食管黏膜、食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中STAT3 mRNA及STAT3蛋白表達(dá)的關(guān)系 正常食管黏膜組織中未見STAT3在mRNA及蛋白水平的共表達(dá)。隨著食管上皮內(nèi)瘤變病變程度的加重，STAT3在mRNA和蛋白水平的共表達(dá)率增加（r＝0.768，P＜0.05），STAT3在 mRNA和蛋白水平的表達(dá)具有一致性（P＜0.05），見表3。

表3 STAT3mRNA和STAT3蛋白表達(dá)的關(guān)系（n）

3 討 論

食管癌具有明顯的地域分布差異，河北省太行山區(qū)是中國食管癌的高發(fā)地區(qū)，過去對該地區(qū)的隨訪研究顯示食管上皮內(nèi)瘤變是多基因參與的，多階段的發(fā)展進行性過程，其發(fā)病機制是人們關(guān)注的焦點。

STAT3是STAT家族的重要成員。作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，STAT3的持續(xù)激活導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化。有研究發(fā)現(xiàn)STAT3在食管癌組織中的表達(dá)異常［6－9］，提示STAT3過度表達(dá)與食管癌的演變過程有關(guān)。另有研究也證實STAT3與早期食管鱗癌具有相關(guān)性［10］，在食管正常黏膜上皮、非典型增生、鱗狀細(xì)胞癌的演變過程中，STAT3的磷酸化水平逐漸增加。王新華等［11］發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌 ECA－109、EC9706細(xì)胞的增殖過程中，STAT3蛋白表達(dá)的活性增強，提示STAT3過度表達(dá)和持續(xù)活化可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究顯示，隨著食管上皮內(nèi)瘤變病變程度的加重和食管癌的出現(xiàn)，STAT3mRNA及STAT3蛋白的陽性表達(dá)率呈逐漸增加的趨勢，且二者均高于正常食管黏膜組，同時，研究還顯示在食管上皮內(nèi)瘤變病變程度加重的過程中STAT3mRNA和STAT3蛋白的共表達(dá)率增加，STAT3在mRNA及蛋白水平的表達(dá)具有一致性，提示STAT3參與了食管上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生及演變過程。在正常食管黏膜中STAT3的激活水平很低，其信號強度遠(yuǎn)不如食管上皮內(nèi)瘤變組織中的STAT3明顯。食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中STAT3的持續(xù)高表達(dá)表明，從食管上皮內(nèi)瘤變到食管癌的演變過程中，不同階段均存在STAT3的高水平激活，使細(xì)胞維持高增殖狀態(tài)，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化；這也提示STAT3的異常表達(dá)為早期事件，在促進食管上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生及向食管癌的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用。

本課題從mRNA及蛋白水平研究了STAT3在食管上皮內(nèi)瘤變及食管癌組織中的表達(dá)，初步探討了STAT3的異?；罨谑彻苌掀?nèi)瘤變演變過程中的作用。但是，STAT3及其下游相關(guān)基因在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用還有待進一步研究。

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