卿小松，孔憲炳

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科 400016）

三磷腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ATP－binding cassette transporter G2，ABCG2）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的三磷腺苷結(jié)合盒（ATP－binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族新成員。研究表明，ABCG2參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥，并能維持干細(xì)胞特性［1－2］。缺氧誘導(dǎo)因子－1α（hypoxia－inducible factor－1alpha，HIF－lα）是目前發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)最關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，它可促進(jìn)血管形成，維持細(xì)胞氧及代謝平衡，以保證腫瘤生長(zhǎng)，并導(dǎo)致化療耐受［3－4］。本實(shí)驗(yàn)研究了在缺氧條件下人肝癌SMMC－7721細(xì)胞ABCG2和HIF－1α表達(dá)的變化，探索二者表達(dá)的關(guān)系，并進(jìn)一步探討缺氧誘導(dǎo)ABCG2表達(dá)的可能機(jī)制，為抗腫瘤治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC－7721細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)普外科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)于Gibco公司；抗HIF－1α多克隆兔抗人抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；抗ABCG2多克隆兔抗人抗體購(gòu)自武漢博士德公司；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔第二抗體及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminecence，ECL）試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；HIF－lα抑制劑3－（5′－羥甲基－2′－呋喃 ）－1－芐 基 吲 唑 ［3－（5′－h(huán)ydroxymethyl－2′－furyl）－1－benzylindazole，YC－1］購(gòu)自Cayman公司；全細(xì)胞裂解液及聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購(gòu)自博海生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC－7721細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將其分為對(duì)照組及缺氧組。對(duì)照組在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%匯合狀態(tài)時(shí)，缺氧組細(xì)胞放入含1%O2、94%N2、5%CO2混合氣體的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)缺氧時(shí)間，缺氧組再分為缺氧24h組、缺氧48h組及缺氧72h組。

1.3 HIF－1α與ABCG2蛋白的檢測(cè) 收獲培養(yǎng)的各組細(xì)胞，按照全細(xì)胞裂解液說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定總蛋白濃度。取50μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，麗春紅染色證實(shí)轉(zhuǎn)移成功，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，第一抗體封閉過(guò)夜，第二抗體37℃孵育1h。第一抗體HIF－1α抗體1∶100稀釋?zhuān)珹BCG2抗體1∶100稀釋?zhuān)诙贵w工作濃度均為1∶1 000。ECL顯影，Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，將 HIF－1α與ABCG2灰度值分別與甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）灰度值的比值作為蛋白表達(dá)水平的參數(shù)，對(duì)產(chǎn)物相對(duì)定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 YC－1抑制 SMMC－7721細(xì)胞 HIF－1α表達(dá)后對(duì) ABCG2表達(dá)的影響 將缺氧72h組SMMC－7721細(xì)胞加入 HIF－1α抑制 劑 YC－1，按 YC－1 終 濃 度 分 為 YC－1 1.0、2.0 及4.0μmol／L組，將不含 YC－1的缺氧72h組SMMC－7721細(xì)胞設(shè)為YC－1對(duì)照組。各組分別處理24h后，采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF－1α、ABCG2蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，行SNK方差分析及Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧環(huán)境SMMC－7721細(xì)胞 HIF－1α、ABCG2蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，在缺氧條件下SMMC－7721細(xì)胞中 HIF－1α蛋白表達(dá)上調(diào)，HIF－1α的表達(dá)在缺氧24h時(shí)即開(kāi)始增加，48h穩(wěn)步上升，72h達(dá)到高峰，各缺氧組SMMC－7721細(xì)胞HIF－1α的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。ABCG2的表達(dá)趨勢(shì)同HIF－1α的表達(dá)，二者表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.944，P＜0.05），表明隨著缺氧的加劇，HIF－1α與ABCG2蛋白表達(dá)逐漸增加。

圖1 Western blot檢測(cè)缺氧環(huán)境SMMC－7721細(xì)胞HIF－1α與ABCG2蛋白的表達(dá)

表1 Western blot檢測(cè)SMMC－7721細(xì)胞中 HIF－1α與ABCG2蛋白的表達(dá)（±s）

表1 Western blot檢測(cè)SMMC－7721細(xì)胞中 HIF－1α與ABCG2蛋白的表達(dá)（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與缺氧24h組比較；△：與缺氧48h組比較。

組別 HIF－1αABCG2對(duì)照組0.184±0.017 0.087±0.017缺氧24h組 0.289±0.044＊ 0.166±0.019＊缺氧48h組 0.385±0.044＊ 0.227±0.034＊缺氧72h組 0.608±0.090＊＃△ 0.344±0.061＊?！?/p>

圖2 不同濃度 YC－1對(duì)SMMC－7721細(xì)胞 HIF－1α、ABCG2蛋白表達(dá)的影響

2.2 YC－1抑制 SMMC－7721細(xì)胞 HIF－1α表達(dá)后對(duì) ABCG2表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著YC－1濃度的增加，缺氧72h組SMMC－7721細(xì)胞中HIF－1α蛋白表達(dá)逐漸減少，同時(shí) ABCG2表達(dá)亦逐漸下降，除 YC－1 1.0μmol／L組與YC－1 2.0μmol／L組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表2。

表2 不同濃度 YC－1對(duì) HIF－1α、ABCG2表達(dá)的影響（±s）

表2 不同濃度 YC－1對(duì) HIF－1α、ABCG2表達(dá)的影響（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與 YC－1 1.0μmol／L組比較；△ ：與 YC－1 2.0μmol／L組比較。

組別 HIF－1αABCG2 YC－1對(duì)照組0.615±0.059 0.509±0.087 YC－1 1.0μmol／L組 0.387±0.054＊ 0.287±0.039＊YC－1 2.0μmol／L組 0.315±0.030＊ 0.239±0.033＊YC－1 4.0μmol／L組 0.085±0.020＊?！?0.105±0.019＊?！?/p>

3 討 論

ABCG2首次發(fā)現(xiàn)于乳腺癌 MCF－7／Adr－Vp3000細(xì)胞系，因此，又稱(chēng)為乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）［5］。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中亦有表達(dá)［6－7］。ABCG2作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以將多種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的藥物“泵出”細(xì)胞外，其轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物包括：多柔比星、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇及拓?fù)涮婵档龋浣閷?dǎo)的多藥耐藥（multi－drug resistance，MDR）是導(dǎo)致臨床化療失敗的原因之一［8－9］。腫瘤生長(zhǎng)快，代謝旺盛，耗氧量大，而腫瘤內(nèi)部的血管生成則相對(duì)較慢，因而缺氧幾乎是所有實(shí)體瘤微環(huán)境的共同特征。缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)亞鐵血紅素、卟啉類(lèi)化合物等物質(zhì)大量堆積，它們可破壞細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)及包膜脂質(zhì)。此外，缺氧微環(huán)境還是造成化療耐藥的原因之一。

趙大偉等［10］發(fā)現(xiàn)ABCG2蛋白在正常肝組織及肝硬化組織中均有表達(dá)，呈弱陽(yáng)性。在肝癌組織中，ABCG2表達(dá)約2／3呈弱陽(yáng)性，1／3呈強(qiáng)陽(yáng)性；ABCG2表達(dá)水平與腫瘤直徑及數(shù)目有關(guān)。ABCG2還是肝癌側(cè)群細(xì)胞表型的主要因素，后者具有腫瘤干細(xì)胞特性，而腫瘤干細(xì)胞目前被認(rèn)為是維持腫瘤生長(zhǎng)及化療失敗的根本原因［10－12］。因此，ABCG2可能對(duì)維持肝癌生長(zhǎng)和化療耐藥發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境中SMMC－7721細(xì)胞ABCG2的表達(dá)較常氧環(huán)境中的表達(dá)增加，這與Krishnamurthy等［13］的研究結(jié)果相符。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，ABCG2的表達(dá)隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，隨著缺氧加劇，細(xì)胞能量供求矛盾突出，細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑代謝物不斷積累，腫瘤細(xì)胞上調(diào)ABCG2表達(dá)以將這些代謝產(chǎn)物排出體外，抵抗缺氧帶來(lái)的傷害，而由此導(dǎo)致的ABCG2表達(dá)增加可能是缺氧下腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制之一。

HIF－lα在細(xì)胞缺氧信號(hào)途徑中處于核心位置，它可以促進(jìn)新生血管形成，維持氧及代謝平衡，以保證腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)其轉(zhuǎn)移，并引起化療耐受［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧時(shí)SMMC－7721細(xì)胞HIF－lα的表達(dá)強(qiáng)于常氧環(huán)境，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，這表明在持續(xù)缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)HIF－lα的表達(dá)來(lái)維持氧及代謝平衡，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而這種表達(dá)趨勢(shì)也與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ABCG2和 HIF－1α在SMMC－7721細(xì)胞中的表達(dá)水平隨著缺氧信號(hào)的加強(qiáng)而呈現(xiàn)出一致的增高趨勢(shì)，且二者表達(dá)呈正相關(guān)。有關(guān)研究顯示，HIF－1α可調(diào)控40余種基因的表達(dá)，諸如MDR1便是其調(diào)控的靶基因之一［15］，而MDR1基因編碼產(chǎn)物 P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－GP）與 ABCG2同屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，這就提示ABCG2是HIF－1α的下游目的基因，HIF－1α可上調(diào)ABCG2的表達(dá)。為了證明這一假設(shè)，本研究采用 HIF－1α抑制劑YC－1干預(yù) HIF－1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著YC－1濃度的增加，HIF－1α的表達(dá)水平逐漸下降，更重要的是，ABCG2的表達(dá)亦逐漸降低，這表明ABCG2是HIF－1α的相關(guān)調(diào)控蛋白，缺氧對(duì)ABCG2的調(diào)控是通過(guò)HIF－1α的機(jī)制而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，缺氧環(huán)境中，SMMC－7721細(xì)胞ABCG2和HIF－1α的表達(dá)上調(diào)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，YC－1抑制HIF－1α后可有效下調(diào)ABCG2的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)表明缺氧時(shí)SMMC－7721細(xì)胞生存及耐藥的機(jī)制可能是通過(guò)缺氧誘導(dǎo)HIF－1α的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，后者上調(diào)ABCG2的表達(dá)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力及化療抵抗能力。抑制HIF－1α－ABCG2這一途徑有望成為治療肝癌以及逆轉(zhuǎn)肝癌患者耐藥的治療靶點(diǎn)。

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