周 杰，陳禮剛，李定君，黃昌仁，劉洛同，明 揚，張 苓，李 昊

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川瀘州646000）

顱內(nèi)動脈瘤一旦破裂會帶來極嚴重后果，而在其破裂之前如能早期發(fā)現(xiàn)并給予積極治療，可明顯降低患者的致殘率和病死率，因此，對顱內(nèi)動脈瘤的篩查及治療具有重要意義。但目前這方面的研究尚少［1－2］。本實驗擬采用表面增強激光解吸／離子化飛行時間質(zhì)譜（surface－enhanced laser desorption／inionation－time of flight－mass spectra，SELDI－TOF－MS）技術(shù)篩選顱內(nèi)動脈瘤患者血清特異蛋白標(biāo)記物，建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型，為早期、無創(chuàng)篩選顱內(nèi)動脈瘤提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入病例為2007年7月至2010年12月本院神經(jīng)外科收治的顱內(nèi)動脈瘤患者。將45例顱內(nèi)動脈瘤破裂患者作為破裂組，其中，男26例，女19例；年齡（45.1±7.1）歲。同時期收治的顱內(nèi)動脈瘤未破裂患者作為未破裂組，其中，男28例，女17例；年齡（46.2±6.5）歲。將45例同時期于本院門診部體檢的健康者作為對照組，其中，男23例，女22例；年齡（47.1±6.9）歲。所有顱內(nèi)動脈瘤患者經(jīng)計算機斷層掃描血管造影（computed tomography angiography，CTA）、數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）檢查證實，均無動脈瘤和蛛網(wǎng)膜下腔出血家族史、腦出血及遺傳性疾病史。

1.2 主要試劑與儀器 芥子酸、乙腈、三氟乙酸、甲醇、Tris－HCl、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）、丙酮及甲酸等均購自美國Sigma公司。金屬親和表面蛋白芯片、PBSⅡ／C型蛋白質(zhì)指紋圖譜儀系統(tǒng)均為美國Ciphergen公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)本收集 所有受試者清晨空腹，于前臂靜脈采血5mL，4℃下靜置30min，2h內(nèi)送本院檢驗科蛋白組學(xué)實驗室。4℃下離心5min（離心半徑8cm，3 000r／min），取上清液（即血清）放入－80℃冰箱保存。實驗時，從－80℃冰箱中取出樣本，冰上融解0.5～1.0h，4℃下離心2min（離心半徑8cm，10 000r／min），待用。

1.4 芯片檢測 吸取10mL芥子酸溶液（芥子酸溶于50%乙腈和0.5%三氟乙酸所得的飽和溶液）與血清等量混合，芯片活化，吸取2mL混合液點樣，晾干后再加入1μL芥子酸，室溫下干燥，上機檢測。設(shè)定參數(shù)：從相對分子質(zhì)量為1.0×106開始檢測，檢測最大相對分子質(zhì)量為1.0×108，相對分子質(zhì)量優(yōu)化范圍為2.0×106～2.0×107，激光強度為210，開始檢測靈敏度為9，集中在優(yōu)化中心，用定量的方法獲取數(shù)據(jù)，設(shè)置SELDI參數(shù)位置為20，開始位置為20，結(jié)束位置為80，每個位置平均5次遞增。利用PBSⅡ／C型蛋白質(zhì)指紋圖譜儀對結(jié)合在芯片表面的血清蛋白質(zhì)進行檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理和模型建立 采用Ciphergen Proteinchip軟件自動采集實驗數(shù)據(jù)，采用Biomarker Wizard 3.1軟件分別分析未破裂組和對照組（各30例）、未破裂組和破裂組 （各30例）的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異，對實驗數(shù)據(jù)進行聚類分析和統(tǒng)計學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對檢測數(shù)據(jù)進行分析及優(yōu)化，分別建立診斷模型。利用測試集樣本（各15例）對模型進行雙盲法驗證，評價模型的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1 差異蛋白的檢測 （1）檢測未破裂組和對照組血清共獲得135個蛋白質(zhì)峰，兩組有54個蛋白質(zhì)峰表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中8個蛋白質(zhì)峰荷質(zhì)比分布于2 000～20 000之間，兩組比較差異顯著（P＜0.01）。在未破裂組與對照組血清中篩選差異表達的2個蛋白質(zhì)峰分別為3 367.7和5 857.5，兩組血清蛋白指紋圖譜及相應(yīng)的凝膠電泳圖比較見圖1。（2）檢測未破裂組和破裂組血清共獲得265個蛋白質(zhì)峰，兩組有79個蛋白質(zhì)峰表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中14個蛋白質(zhì)峰荷質(zhì)比分布于2 000～20 000之間，兩組比較差異顯著（P＜0.01）。在未破裂組與破裂組血清中篩選差異表達的2個蛋白質(zhì)峰分別為6 642.0和9 127.5，兩組血清蛋白指紋圖譜及相應(yīng)的凝膠電泳圖比較見圖2。

2.2 建立篩選預(yù)測模型 （1）以荷質(zhì)比為2 540.6、3 367.7、5 857.5及8 231.0的4個蛋白質(zhì)峰作為輸入節(jié)點建立的模型，其模擬計算的網(wǎng)絡(luò)誤差值最低，其中，以荷質(zhì)比為2 540.6、3 367.7及5 857.5的差異蛋白對比正常血清表達顯著升高（P＜0.01）；荷質(zhì)比為8231.0的差異蛋白對比正常血清表達顯著降低（P＜0.01），見表1。（2）以荷質(zhì)比為 2 938.2、4 065.3、6 642.0、9 127.5及16 021.6的5個蛋白質(zhì)峰作為輸入節(jié)點建立的模型，其模擬計算的網(wǎng)絡(luò)誤差值最低。其中，以荷質(zhì)比為2 938.2、16 021.6的差異蛋白對比破裂組血清表達顯著升高（P＜0.01）；荷質(zhì)比為4 065.3、6 642.0及9 127.5的差異蛋白對比破裂組血清表達顯著降低（P＜0.01），見表2。

圖1 未破裂組和對照組血清的蛋白指紋圖譜及凝膠電泳圖比較

圖2 未破裂組和破裂組血清的蛋白指紋圖譜及凝膠電泳圖比較

表1 4種差異蛋白質(zhì)在未破裂組和對照組中的質(zhì)譜峰值

2.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的雙盲法驗證 利用建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型對測試集中樣本（各15例）分別進行雙盲法測試。驗證結(jié)果顯示：（1）15例未破裂組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.5～1.0）有1例判錯；而在15例對照組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.0～0.5）有1例判錯。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析處理，其靈敏度為93.3%，特異度為93.3%，陽性預(yù)測值為93.3%，陰性預(yù)測值93.3%。利用結(jié)果數(shù)據(jù)繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic curve，ROC）曲線，ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC）為0.920（＞0.7），說明該診斷模型準(zhǔn)確，見圖3。（2）15例未破裂組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.5～1.0）有1例判錯；而在15例破裂組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.0～0.5）有2例判錯。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析處理，其靈敏度為93.3%，特異度為86.7%，陽性預(yù)測值為87.5%，陰性預(yù)測值92.9%。利用結(jié)果數(shù)據(jù)繪制的ROC曲線，AUC為0.858（＞0.7），說明該診斷模型準(zhǔn)確，見圖4。

表2 5種差異蛋白質(zhì)在未破裂動脈瘤和破裂動脈瘤組中的質(zhì)譜峰值

圖3 未破裂組與對照組人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的ROC曲線分析

圖4 未破裂組與破裂組人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的ROC曲線分析

3 討 論

目前，對于未破裂動脈瘤的篩選工作開展較少，尚缺乏快捷、行之有效的方法對顱內(nèi)動脈瘤進行早期篩選和預(yù)測。DSA和CTA是目前診斷顱內(nèi)動脈瘤的主要手段，但它們不能作為顱內(nèi)動脈瘤的大規(guī)模篩選手段［3－4］。近年來越來越多的顱內(nèi)動脈瘤在例行體格檢查或因其他原因行頭部磁共振成像、磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）檢查時被發(fā)現(xiàn)，因MRA無創(chuàng)、無輻射，且在顱內(nèi)動脈瘤的診斷方面具有一定價值，相對DSA、CTA而言，它更適合用于人群的篩查。但作為篩查手段，MRA存在檢查時間長、噪音大、費用高的弊端，且MRA可能漏診或誤診較小動脈瘤和大動脈瘤［5］。鑒于動脈瘤破裂后的嚴重后果，確立可靠的無創(chuàng)篩查手段具有重要意義。

目前，尚不清楚顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制，它可能與遺傳、血流動力學(xué)以及后天退行性變等多種因素相關(guān)。研究表明基因突變、缺失以及表達異常在顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，因此，從分子水平上研究顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制，進而對其進行基因診斷和治療成為該領(lǐng)域的最新研究方向［6］。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展極大地推動了疾病生物標(biāo)志物的研究，它可以從整體水平上對一個細胞、一種組織中所包含的全部蛋白質(zhì)進行時間和空間上的動態(tài)研究［7－8］。因此，對顱內(nèi)動脈瘤患者血清蛋白指紋圖譜的研究有可能發(fā)現(xiàn)特異性顱內(nèi)動脈瘤診斷的生物標(biāo)志。SELDI－TOF－MS技術(shù)檢測的基本原理是基于特殊芯片的表面加強吸附，芯池中的分析物經(jīng)激光脈沖輻射，解吸形成荷電離子，不同荷質(zhì)比的離子在儀器漂移管中飛行的時間不同，質(zhì)量越小，所帶電荷越多的離子，其荷質(zhì)比越小，飛行時間越短，檢測器可對其進行檢測并繪制成質(zhì)譜圖，經(jīng)計算機軟件處理后形成模擬圖譜［9］，將對照組與某種疾病或疾病不同階段的圖譜進行比較，可發(fā)現(xiàn)和捕捉特異相關(guān)蛋白。該技術(shù)優(yōu)點在于：（1）可分析經(jīng)典技術(shù)無法分析的蛋白質(zhì)，包括疏水蛋白質(zhì)、等電點過高或過低的蛋白質(zhì)；（2）獲得的圖譜單一，重復(fù)性好，可用于定量分析；（3）樣品無需純化，可分析復(fù)雜的生物樣品，增加發(fā)現(xiàn)生物學(xué)標(biāo)志的機會；（4）樣品需要量少，檢測速度快，適合臨床診斷及大規(guī)模篩選。近年來，它已被廣泛用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和定義、蛋白質(zhì)功能分析、腫瘤標(biāo)志物篩選及藥學(xué)研究等領(lǐng)域，同時，對顱腦損傷和顱內(nèi)腫瘤進行的初步研究顯示其在這一領(lǐng)域也具有一定的臨床應(yīng)用價值，但目前尚無顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)文獻的報道［10－14］。

SELDI－TOF－MS技術(shù)的應(yīng)用為大規(guī)模人群篩選提供了可能。Zhang等［15］運用SELDI－TOF－MS技術(shù)建立的診斷模型檢測彌漫性大B細胞淋巴瘤的特異度和敏感度均為94%，檢測預(yù)后不良患者的特異度為92%，敏感度為94%。呂晶晶等［16］用結(jié)直腸腺瘤患者、結(jié)直腸良性疾病患者及正常人血清的3種表達差異蛋白質(zhì)的荷質(zhì)比建立診斷模型，該模型的診斷準(zhǔn)確率為87.70%、靈敏度為71.43%、總特異度為96.25%、陽性預(yù)測值為90.91%。本研究結(jié)果表明運用SELDI－TOF－MS技術(shù)檢測未破裂組、破裂組及對照組患者的血清標(biāo)本，獲取相應(yīng)血清蛋白表達指紋圖譜，經(jīng)統(tǒng)計分析以篩選未破裂組患者血清可能存在的特異蛋白是可行的，未破裂組、破裂組及對照組患者血清蛋白質(zhì)譜的表達具有顯著的差異性。根據(jù)不同分組的差異蛋白，運用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分別建立其診斷模型，其AUC＞0.7，說明該方法所建立的診斷模型準(zhǔn)確可靠，可以作為未破裂顱內(nèi)動脈瘤患者的潛在篩選手段。雙盲法驗證此診斷模型顯示其可在短時間內(nèi)較好地區(qū)分未破裂動脈瘤患者、破裂動脈瘤患者及健康者，說明該診斷模型適合于未破裂動脈瘤的篩選工作。

利用SELDI－TOF－MS技術(shù)篩選的血清特異蛋白標(biāo)志物作為篩選顱內(nèi)動脈瘤實驗指標(biāo)具有重要的潛在價值和一定的應(yīng)用前景。首先，該方法血清樣本容易獲得，對患者創(chuàng)傷性小，檢查耗時短，費用低，有利于臨床高危人群篩選的應(yīng)用和推廣；其次，通過對顱內(nèi)動脈瘤的蛋白質(zhì)表達差異情況進行研究，進而對差異蛋白數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物學(xué)功能進行全面分析，明確顱內(nèi)動脈瘤血清差異蛋白在此疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，從而對顱內(nèi)動脈瘤進行診斷和篩選，并可對這些“關(guān)鍵”蛋白進行干預(yù)，為基因治療顱內(nèi)動脈瘤提供臨床和實驗資料。然而，本研究在諸多方面還需進一步深入，如對實驗方法學(xué)的完善以及實驗條件的標(biāo)準(zhǔn)化，以增強實驗可重復(fù)性，并進行多中心、大樣本的聯(lián)合研究。通過對這些潛在的生物標(biāo)志物進行精確鑒定，確定其在動脈瘤發(fā)生、發(fā)展、破裂過程中的具體作用，為顱內(nèi)動脈瘤的臨床篩選提供可靠的實驗依據(jù)。

［1］ Menghini VV，Brown RD Jr，Sicks JD，et al.Clinical manifestations and survival rates among patients with saccular intracranial aneurysms：population－based study in Olmsted County，Minnesota，1965to 1995［J］.Neurosurgery，2001，49（2）：251－256.

［2］ 翟寶進，劉欣民，李雙英，等.顱內(nèi)動脈瘤患者血清差異表達蛋白質(zhì)的研究［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2010，26（10）：891－895.

［3］Joo SP，Kim TS，Kim YS，et al.Clinical utility of multislice computed tomographic angiography for detection of cerebral vasospasm in acute subarachnoid hemorrhage［J］.Minim Invasive Neurosurg，2006，49（5）：286－290.

［4］ 林維斌，何理盛.顱內(nèi)動脈瘤診斷與治療的現(xiàn)狀及進展［J］.福建醫(yī)藥雜志，2007，29（2）：98－100.

［5］ Yang YJ，Chen WJ，Zhang Y，et al.Diagnostic value of CTA and MRA in intracranial traumatic aneurysms［J］.Chin J Traumatol，2007，10（1）：29－33.

［6］ 楊呈浩，李定君，詹書良.與顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病機制相關(guān)基因研究現(xiàn)狀［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，30（6）：541－543.

［7］ Lu HB，Zhou JH，Ma YY，et al.Five serum proteins identified using SELDI－TOF－MS as potential biomarkers of gastric cancer［J］.Jpn J Clin Oncol，2010，40（4）：336－342.

［8］ Araki Y，Yoshikawa K，Okamoto S，et al.Identification of novel biomarker candidates by proteomic analysis of cerebrospinal fluid from patients with moyamoya disease using SELDI－TOF－MS［J］.BMC Neurol，2010，10：112.

［9］ 伍健，黃培林.SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2004，23（5）：347－350.

［10］Lin YW，Lin CY，Lai HC，et al.Plasma proteomic pattern as biomarkers for ovarian can cer［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16Suppl 1：S139－146.

［11］譚小林，任興軍，王開正，等.食管癌血清差異蛋白質(zhì)組測定結(jié)果分析［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011.40（7）：641－643.

［12］張蓉，張莉.心理訓(xùn)練對心理應(yīng)激后陸軍特種兵血清蛋白質(zhì)譜特征的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011，35（9）：985－987.

［13］李杰，陳茂偉，周怡，等.乙肝肝纖維化血清標(biāo)記物篩選的初步研究［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（15）：2724－2727

［14］Dursun E，Monari E，Cuoghi A，et al.Proteomic profiling during atherosclerosis progression using SELDI－TOFMS：effect of darbepoetin treatment［J］.Acta Histochem，2010，112（5）：432－443.

［15］Zhang MZ，Sun ZC，F(xiàn)u XR，et aI.Analysis of serum proteome profiles of non－Hodgkin lymphoma for biomarker identification［J］.J Proteomics，2009，72（6）：952－959.

［16］呂晶晶，高春芳，王秀麗，等.SELDI－TOF－MS技術(shù)在結(jié)直腸腺瘤血清蛋白質(zhì)指紋圖譜篩查模型建立中的應(yīng)用［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（34）：7－9.