文 / Petra Lutter Marie Claude Savoy Perroud 等

季 昀 龐學(xué)燕 譯 揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

1 引言

三聚氰胺，化學(xué)名為2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪，被用于大批量生產(chǎn)制造積層塑膠板、塑料涂膜、商業(yè)濾器、膠水或粘合劑以及一些餐具和廚房用品的三聚氰胺甲醛樹脂（Bradley，Boughtfower，Smith，Speck，Castle，2005；Lund，Petersen，2006；Martin，Hizo，Ong，Alba，Ishiwata，1992）。2007年，有人為了提高食品中的蛋白質(zhì)含量測定值，故意將三聚氰胺添加到谷朊粉或其它以谷物為原料的成分中，制作寵物食物。由于三聚氰胺是一種廉價，且在全世界范圍都很容易得到的化學(xué)藥品，因此其受到了很多不法分子的利用。有文獻(xiàn)已經(jīng)報道了一些寵物食品中三聚氰胺的檢測方法（Heller，Nochetto，2008；Kimetal，2008；Muniz Valencia et al，2008；Vail，Jones，Sparkman，2007）。近年來，在中國發(fā)生的“嬰幼兒奶粉事件”對嬰兒的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的不利影響（WHO/FAO，2008），因此進(jìn)一步加強對牛奶供應(yīng)鏈和成品的合理控制已經(jīng)成為必需。

食品中添加三聚氰胺所帶來的危害，不僅是因為摻假，還有許多不同原因也可導(dǎo)致食品受三聚氰胺的污染。這些原因從環(huán)丙氨嗪（殺蟲劑）的分解（Patakioutas，Savvas，Matakoulis，Sakellarides， Albanis，2007；Yokley，Mayer，Rezaaiyan，Manuli，Cheung，2000）到經(jīng)過檢驗的食品包裝材料的轉(zhuǎn)移（歐盟指令2002/72/EC）。近來，倍受關(guān)注的是牛奶中三聚氰胺的檢出，其原因可能是用作動物飼料的成分污染了三聚氰胺導(dǎo)致的（Cruywagen，Stander，Adonis，Calitz，2009）。有試驗結(jié)果表明，給奶牛飼喂含0.015%（w/w）的三聚氰胺的濃縮顆粒料將顯著提高牛乳中三聚氰胺的濃度，奶牛吸收被三聚氰胺污染的飼料5 h后，乳中三聚氰胺濃度達(dá)到15 mg/kg。根據(jù)這項研究，估計飼料中約2%的三聚氰胺轉(zhuǎn)移到了乳中。因而急需能夠檢測和定量乳中三聚氰胺的方法，以確保乳制品，尤其是嬰兒奶粉的安全性。

本試驗描述了與牛乳（CM）及以牛奶為原料的嬰兒配方奶粉（MBPIF）中三聚氰胺的檢測有關(guān)的2 種篩選方法和2 種定量方法。篩選方法是酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和液相色譜法聯(lián)合紫外線檢測（HPLC-UV），而定量方法則是基于質(zhì)譜分析技術(shù)的。簡單而經(jīng)濟(jì)的ELISA對于控制CM中潛在的摻假是一個有用的工具，而液相色譜法聯(lián)合紫外線檢測（HPLC-UV）適用于檢測產(chǎn)品的質(zhì)量，因為這種技術(shù)能夠獲得精確的定量數(shù)據(jù)。鑒定分析是基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）以及液相層析串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），這些源于質(zhì)譜分析法的分析技術(shù)之所以被作為定量方法是因為這種檢測方式為被測物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)提供了信息。本文報道了4 種方法的效果和測定數(shù)據(jù)，并討論了以國內(nèi)和歐洲的測定效果為體系得到的結(jié)果。

2 材料與方法

2.1 化學(xué)試劑

三聚氰胺（2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪）、三聚氰酸、辛基磺酸、嘧啶99%、青霉素G，購自Sigmae-Aldrich公司（布克斯，瑞士）；標(biāo)記同位素的同系物（13C3，15N3）三聚氰胺（同位素純度：13C3，99%；氨基-15N3，98%，化學(xué)純度≥98%），由劍橋同位素實驗室提供（安得沃，MA，美國）；標(biāo)準(zhǔn)品、三聚氰胺一酰胺、環(huán)丙氨嗪，購自Dr Ehrenstorfer公司（奧格斯堡，德國）；醋酸銨、氨水（5%）、濃甲酸（98%～100%）、LiChrosolv乙腈、LiChrosolv甲醇、LiChrosolv水、ZnSO4·7H2O、Lichrolut強陽離子交換SCX固相萃取小柱，購自Merck公司（達(dá)姆施塔特，德國）；K4Fe（CN）6·3H2O、氯霉素、磺胺甲嘧啶，購自Riedel-de-Haen（塞爾策，德國）；三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒，購自Abraxis（沃明斯特，美國賓夕法尼亞州）；環(huán)丙沙星，購自Fluka；OASIS MCX 6 cc/500 mg SPE小柱，購自Waters（Waters S.A.S.，Saint-Quentin En Yve- lines，法國），作為衍生劑的BSTFA-TMCS（99+1），購自Supelco。

2.2 食品樣本

實驗室樣本是CM或以CM為原料的MBPIF。CM源自當(dāng)?shù)刂评覐S，使用前4 ℃保存。新鮮牛乳的實驗室樣本在取實驗用量之前要再次混勻以防油脂相和水相分離。MBPIF取自一些當(dāng)?shù)氐某?，為保證均質(zhì)化，每包奶粉全部轉(zhuǎn)移到容量為實驗室樣本容量2 倍的樣本容器中，容器反復(fù)搖晃和顛倒。

2.3 ELISA

2.3.1 樣本的前處理

三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒可在室溫操作。漂洗緩沖液用蒸餾水（850 mL）稀釋5 倍。樣本稀釋緩沖液是PBS/甲醇（10%）溶液，它是用蒸餾水溶解NaH2PO4·H2O（0.49 g）、Na2HPO4（2.05 g）和NaCl（16.2 g）制成，可選擇性用NaOH（1 M）或HCl（1 M）調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.4，然后加100 mL甲醇，用蒸餾水定容至1 000 mL。Carrez I溶液是用200 mL蒸餾水溶解7.2 g K4Fe（CN）6·3H2O制成。Carrez II溶液是用200 mL蒸餾水溶解14.4 g ZnSO4·7H2O制成。準(zhǔn)備好三聚氰胺HRP酶交聯(lián)底物終止液和用于校正的標(biāo)準(zhǔn)溶液以及三聚氰胺定量檢測試劑盒（Abraxis）。稀釋緩沖液濃度按照試劑盒制造商的描述制備。試驗使用三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（0.2 mg/mL），通過稀釋三聚氰胺儲備溶液來測定回收率。

CM分析之前不進(jìn)行進(jìn)一步處理。MBPIF取1 g溶于8 mL樣品稀釋緩沖液中，漩渦處理10 s，在機(jī)械搖動器上劇烈搖動10 min。1 mL每份的CM或MBPIF轉(zhuǎn)入微量離心管?？瞻讟悠芳尤胂鄳?yīng)量的三聚氰胺。Carrez I 溶液（250 μL）和Carrez II溶液（250 μL）相繼添加到樣本中，混合物漩渦10 s，然后離心（臺式離心機(jī)Eppendorf，室溫下3 000 rpm離心5 min）。將上層液體（0.5 mL）分別轉(zhuǎn)移到一個玻璃試管中，然后用等體積的樣本稀釋緩沖液稀釋。根據(jù)ELISA試劑盒說明書對稀釋液進(jìn)行分析。為檢測免疫反應(yīng)，CM樣本加入標(biāo)準(zhǔn)的三聚氰胺衍生物，如三聚氰酸二酰胺、三聚氰胺一酰胺、三聚氰酸和環(huán)丙氨嗪（殺蟲劑）以及獸藥環(huán)丙沙星、氯霉素、磺胺甲嘧啶和青霉素G。

2.3.2 檢測條件

將100 μL添加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的溶液（0、20、50、100、200和500 ng/mL）分別一式2 份，每份加入三聚氰胺HRP酶交聯(lián)物50 μL，室溫孵育30 min后，用250 μL洗滌液洗滌4 次，然后添加基質(zhì)溶液100 μL。室溫培養(yǎng)30 min后，加入100 μL終止液后，使顯色反應(yīng)終止，使用分光光度計于450 nm下測定吸光值。

2.3.3 定量

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線（線性log回歸）計算未知濃度。每個試驗都設(shè)有陽性對照和陰性對照。

2.4 HPLC-UV

2.4.1 樣本的處理

稱取5 g CM、1 g MBPIF樣品（蛋白質(zhì)含量大于15%）或2 g MBPIF樣品（蛋白質(zhì)含量小于15%）裝入50 mL離心管中。向粉末樣品中加入5 mL蒸餾水，攪拌使粉末溶解后，加入新鮮配制的三氯乙酸（2%）∶乙腈（1∶9）溶液5 mL，劇烈搖動1 min，然后將離心管在室溫下放置15 min，再以4 000×g離心10 min。同時，用6 mL甲醇和6 mL水處理MCX強陽離子交換固相萃取柱6 cc/500 mg。將離心后所得上清液（4 mL）緩慢通過柱子。洗脫之前用蒸餾水（2×6）mL和甲醇（2×6）mL，然后用5 mL含有1.25%氨的甲醇溶液直接洗脫入7 mL小瓶中。洗脫液于50 ℃氮氣吹干，再溶解于1 mL 0.1%的甲酸∶乙腈混合液（9∶1）中，HPLC分析之前用0.45 μm再生纖維素過濾器過濾。

2.4.2 儀器條件

液相色譜分析是利用Waters四元泵裝置（Waters Alliance）通過C18液相層析柱（Discovery C18，250 mm×4.6 mm，5 μm，Supelco）進(jìn)行的。流動相由溶液A和溶液B組成，溶液A為辛基磺酸（33 mM）溶于按85∶15體積比配成的磷酸鹽緩沖液-乙腈水溶液；溶液B為乙腈。100%的溶液A等度分離15 min，然后用50%溶液A和50%溶液B洗脫1 min（液相層析柱用100%溶液A再沖洗4 min）。流速設(shè)為1.0 mL/min，將10 μL稀釋液注入柱中。于240 nm測定吸光度并于200～400 nm記錄紫外光譜加以驗證。通過與純?nèi)矍璋窐?biāo)準(zhǔn)品比較保留時間和峰的紫外光譜特征來鑒定三聚氰胺。

2.4.3 定量

通過外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量三聚氰胺，該標(biāo)準(zhǔn)曲線所含有的三聚氰胺濃度范圍在0.1～5.0 μg/mL （x），通過與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較峰高（y）來定量試驗溶液的三聚氰胺濃度。通過計算響應(yīng)系數(shù)（RF，RF = y/x）平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來檢驗紫外反應(yīng)的線性度，線性度應(yīng)當(dāng)?shù)陀?5%（Rodriguez，Orescan，1998）。

2.5 GC-MS

2.5.1 樣品的前處理

稱取0.5 g被檢的MBPIF裝入50 mL的聚丙烯管中，加入（13C3，15N3）-三聚氰胺（濃度為2 μg/mL水溶液25 μL）作為內(nèi)標(biāo)，同時加入2.5 mL水。再加入20 mL乙腈和1.25 mL 98%～100%的甲酸之前，MBPIF要小心混勻（漩渦至少10 s）。得到的溶液劇烈搖動1 min，然后用Multifuge 3s型離心機(jī)室溫4 000×g離心5 min。預(yù)先用酸性甲醇[2×5 mL甲酸-甲醇（1∶99，v/v），環(huán)境壓力下最大3 mL/mim]和酸化水[2×5 mL甲酸-水（1∶99，v/v），環(huán)境壓力下最大3 mL/mim]處理OASIS MCX固相萃取柱，除去洗脫液。進(jìn)一步用水（2×5 mL，環(huán)境壓力下最大3 mL/min）沖洗柱2 次，再用甲醇沖洗2 次（2×5 mL，環(huán)境壓力下最大3 mL/min）。然后被測物用堿性乙腈[5 mL 25%氨溶液-乙腈（20∶80，v/v）， 環(huán)境壓力下最大3 mL/min]洗脫。洗脫液于50 ℃用氮氣吹干，殘留物溶于0.1 mL嘧啶并在加入雙三甲基硅基三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷（99∶1，v/v，0.1 mL）后衍生（80 ℃，45min）。最后，用0.2 μm再生纖維素過濾器過濾并注入GC-MS（1 μL）。

表1 通過GC-MS檢測離子分析三聚氰胺和同位素標(biāo)記的同源物以及帶有根據(jù)委員會決議2002/657/EC驗收界限的峰面積比

2.5.2 儀器條件

使用HB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm；膜厚度0.25 μm），通過GC7890與MSD5975C聯(lián)合來進(jìn)行GC-MS分析。在15 psi恒壓下以氦氣作為載氣。250 ℃分流進(jìn)樣，引入樣品（1 μL）。烘箱溫度設(shè)定程序如下：70 ℃（1 min）， 25 ℃/min達(dá)150 ℃，3 ℃/min達(dá)190 ℃，50 ℃/min達(dá)280 ℃（10 min）。離子源溫度為230 ℃。在70 eV產(chǎn)生電子轟擊電離源并以SIM模式停留20 ms獲得（表1）。使用Quant Browser程序（http：//home.telfort.nl/sp984084/products/quantbrowser_gcms/）對峰進(jìn)行評價與整合。

2.5.3 定量

MBPIF處理樣在5 個標(biāo)度水平下，范圍從0～1.425 ng（與此范圍等價的濃度為0～0.570 mg/kg）注入到柱中，內(nèi)標(biāo)物固定注入0.25 ng（樣品含0.1 mg/kg），通過外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線[被測物/內(nèi)標(biāo)物面積比（y）對被測物/內(nèi)標(biāo)物濃度比（x）]定量三聚氰胺。通過計算相應(yīng)系數(shù)（RF，RF=y/x）平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來檢驗質(zhì)譜結(jié)果的線性度，線性度應(yīng)當(dāng)?shù)陀?5%（Rodriguez，Orescan，1998）。C

〔本文翻譯自：Petra Lutter,Marie-Claude Savoy-Perroud, etal.Screening and confirmatory methods for the determination of melamine in cow’s milk and milk-based powdered infant formula: Validation and proficiencytests of ELISA, HPLC-UV, GC-MS and LC-MS/MS. Food Control, 2011（22）:903-913.〕

（未完待續(xù)）