王彥霞 陳瑩 李慶威 籍文強(qiáng) 靳萍奎 閆芳

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)最常見的慢性炎性反應(yīng)性疾病之一，由于其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，使其難以從根本上得到治療。本研究通過體外培養(yǎng)COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，檢測其分泌炎性因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-8、IL-10的水平，以探討其在COPD炎性反應(yīng)的作用，為COPD炎癥機(jī)制及其治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2009年10月至2011年3月急診科和呼吸內(nèi)科收住COPD急性加重期患者30例(急性加重期組)，男20例，女10例;平均年齡(58±12)歲。為急性加重期有患者均進(jìn)行肺功能檢測。入選標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組2007年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。COPD急性加重期患者行肺功能檢查，所有病例均進(jìn)行常規(guī)體檢檢查及肺CT檢查等輔助檢查，并排除較嚴(yán)重心腦血管疾病、其他呼吸系統(tǒng)疾病、較嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、腎病、糖尿病等內(nèi)分泌代謝疾病以及重大手術(shù)和結(jié)締組織病等。將COPD急性加重期患者經(jīng)過治療達(dá)到穩(wěn)定期后作為治療后患者(治療后組)進(jìn)行對(duì)比研究。另按年齡匹配入選了30例健康對(duì)照者為對(duì)照組，男18例，女12例;平均年齡(55±11)歲，均為我院同期健康體檢者，近2個(gè)月內(nèi)無呼吸系統(tǒng)疾病史，經(jīng)詢問病史、體格檢查、胸部X線片檢測均未發(fā)現(xiàn)異常。

1.2 方法 對(duì)照組和COPD患者于入院后第2天及治療后癥狀緩解后在無菌條件下，抽取肘靜脈血6 ml，置于肝素抗凝(25 U/ml)管中，輕輕混勻，立即進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。COPD患者于同一天測定第1秒最大呼氣量占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1/pre%)。

1.3 分離單個(gè)核細(xì)胞 用淋巴細(xì)胞分離液分離出每份血液中單個(gè)核細(xì)胞。0.4%胎盤藍(lán)染色，排除無活性的細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)＞90%可采用。用含10%小牛血清的RPM I 1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度均為2.0×106個(gè)/ml，備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 取所有入選者各自等量的PBMC體外培養(yǎng)8 h，上述每例細(xì)胞均設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下孵育相應(yīng)時(shí)間。提取細(xì)胞上清液，封裝后置-20℃冰箱保存，留待測定。

1.5 TNF-α、IL-8、IL-10的測定 用酶聯(lián)免疫吸附法，采用雙抗夾心 ELASE檢測試劑盒(TNF-α、IL-8、IL-10)，試劑盒均購自深圳晶美公司，按照試劑盒說明書操作，每例測試結(jié)果取其平均值。

1.6 肺功能測定 觀察第1秒用力呼吸量占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1/pre%)。用德國耶格公司最新高級(jí)組合式、模塊化的Master Screen Diff usion肺功能儀進(jìn)行檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)或t＇檢驗(yàn)，相關(guān)性采用 Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組PBMC分泌TNF-α、IL-8和IL-10比較 急性加重期組患者PBMC分泌TNF-α和IL-8明顯高于治療后組及對(duì)照組(P＜0.05);治療后組明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);急性加重期組PBMC分泌IL-10明顯低于治療后組及對(duì)照組(P＜0.05);治療后組明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

表1 3組細(xì)胞分泌炎性因子水平及COPD肺功能比較 n=30，±s

表1 3組細(xì)胞分泌炎性因子水平及COPD肺功能比較 n=30，±s

注：與治療后組比較，*P ＜0.05;與對(duì)照組比較，#P ＜0.05;※：未測

組別 TNF-α(pg/ml) IL-8(pg/ml) IL-10(pg/ml)FEV1/pre%急性加重期組 77±6*# 34±6*# 38±5*# 39±5*治療后組 69±5# 30±6# 46±7# 47±5對(duì)照組 57±8 19±5 50±5※

2.2 COPD患者PBMC分泌炎性因子與肺功能相關(guān)性 急性加重期組 TNF-α、IL-8與 FEV1/pre%呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.389，P=0.034;r=-0.513，P=0.004);IL-10與FEV1/pre%呈明顯正相關(guān)(r=0.471，P=0.009)。COPD治療后患者TNF-a、IL-8與FEV1/pre%呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.470，P=0.009;r=-0.495，P=0.005);IL-10與FEV1/pre%呈明顯正相關(guān)(r=0.386，P=0.035)。

3 討論

研究表明，在COPD發(fā)展的不同階段，患者外周血、誘導(dǎo)痰中及肺泡灌洗液中炎性因子 TNF-α和 IL-8水平有明顯差異［2-4］，本實(shí)驗(yàn)從另一方面證明，COPD急性加重期患者PBMC分泌TNF-α和IL-8明顯高于治療后組和對(duì)照組，可見不論來自于何處的炎性介質(zhì)均參與了COPD的炎性反應(yīng)。

TNF-α主要是由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子，直接激活炎性細(xì)胞，使其釋放更多的氧和氮基團(tuán)，使炎癥持續(xù)存在。在COPD慢性炎性中TNF-α除上述作用外，還可促進(jìn)炎性細(xì)胞黏附、游走和浸潤，迅速引起肺損傷［5］;并能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞生成 IL-8。TNF-α和IL-8是構(gòu)成 COPD氣道炎性反應(yīng)復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要成分，加速局部炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，最終導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的重構(gòu)和氣流阻塞的形成。研究提示，COPD急性加重期外周血中TNF-α、IL-8水平及中性粒細(xì)胞釋放O2H量與其肺功能有明顯相關(guān)性［6］。本研究也證明，COPD急性加重期期的患者PBMC分泌TNF-α、IL-8與FEV1/pre%呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)過治療后患者達(dá)到穩(wěn)定期后，其肺功能指標(biāo)較前有所好轉(zhuǎn)，同樣與TNF-α、IL-8水平有明顯負(fù)相關(guān)，提示IL-8和TNF-α均與肺組織損壞程度有關(guān)。炎性細(xì)胞活性越強(qiáng)，其分泌的炎性因子水平就越高，破壞肺組織程度將更嚴(yán)重。

IL-10的主要生物功能是抑制和終止炎性反應(yīng)，阻止炎性因子的分泌，調(diào)節(jié) T、B、NK等細(xì)胞的分化和增殖。許多組織和細(xì)胞都可產(chǎn)生 IL-10。IL-10可使炎性因子TNF-α的mRNA降解;降低 IL-6和 IL-8自身的 mRNA 的穩(wěn)定性［7］，抑制 IL-8、TNF-a的表達(dá)［8］，從而在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后兩個(gè)水平影響炎性因子的合成，參與COPD炎性反應(yīng)。另外，IL-10可使Th1細(xì)胞亞群的增殖分化減弱，促進(jìn)Th2細(xì)胞的大量增及其自分泌大量的IL-10，再對(duì)Th1細(xì)胞的增殖和活化產(chǎn)生進(jìn)一步的抑制作用［8］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，COPD患者氣道炎性反應(yīng)程度不同，外周血中IL-10濃度也有所不同［9］。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平上探討，IL-10含量在COPD不同階段有所不同，并與其相應(yīng)階段的肺功能指標(biāo)呈正相關(guān)，推測氣道炎性反應(yīng)越重，IL-10的濃度越低，促進(jìn)Th2細(xì)胞增殖作用減低，對(duì)Th1細(xì)胞的抑制作用減弱，不足以阻止COPD的炎性反應(yīng)持續(xù)發(fā)展。IL-10水平降低及其調(diào)控分泌的促炎性細(xì)胞因子的增加可能是COPD患者氣道炎癥持續(xù)存在并導(dǎo)致氣道重構(gòu)、氣流受限、肺組織破壞及肺氣腫等病理過程的重要機(jī)制之一。

總之，COPD患者PBMC分泌的炎性介質(zhì)參與了其炎性反應(yīng)，促炎因子失控性分泌，抗炎因子分泌不足是COPD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，而且，炎性因子水平與肺功能有明顯相關(guān)性，表明PBMC分泌炎性因子水平高低可以反應(yīng)肺組織損害的嚴(yán)重程度。有效地抑制促炎因子分泌、提升抗炎因子水平是阻止COPD炎性反應(yīng)、減輕肺組織損壞、改善肺功能、提高COPD患者生存質(zhì)量的重要措施之一。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30：8-17.

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