陳艷明 封萍 嚴(yán)加林

VEGF和CD31在皮膚鱗癌中的表達(dá)

陳艷明 封萍 嚴(yán)加林

目的觀察皮膚鱗癌(SSCC)中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)的表達(dá)，研究其與皮膚鱗癌發(fā)展的關(guān)系。方法采用免疫組化染色法檢測(cè)正常皮膚組織及鱗癌組織中VEGF和CD31的表達(dá)變化。結(jié)果在正常組織中，VEGF和CD31表達(dá)低于鱗癌皮損組織，在Ⅲ～Ⅳ期鱗癌中的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期鱗癌中的表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論VEGF及CD31蛋白的異常表達(dá)在皮膚鱗癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。

鱗癌;免疫組化;VEGF;CD31

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(Squamous Cell Carcinoma，SCC)是最常見的皮膚癌之一。本文主要通過檢測(cè)其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，分析其與皮膚鱗癌發(fā)生過程中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集臨床和病理確診的鱗癌蠟塊40例(Ⅰ～Ⅱ期鱗癌20例，Ⅲ～Ⅳ期鱗癌20例，其中男22例，女18例;年齡40～72歲，平均59.2歲)。20例正常組織中男11例，女9例，年齡41～71歲，平均56.1歲。此兩組年齡、性別無顯著差異性。正常皮膚標(biāo)本經(jīng) 3.33 mol/L(10%)福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片4 μm厚。原蠟塊標(biāo)本直接切片4 μm厚。

1.1.2 鱗癌分期 Ⅰ期:未分化細(xì)胞數(shù) ＜25%;Ⅱ期:未分化細(xì)胞數(shù) ＞25%而 ＜50%;Ⅲ期:未分化細(xì)胞數(shù) ＞50%而＜75%;Ⅳ期:未分化細(xì)胞數(shù) ＞75%［1］。

1.1.3 主要試劑 兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗鼠CD31單克隆抗體由美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)，購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法 免疫組化分析:用多聚賴氨酸處理后的切片，60℃烤片20 min，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS洗3次，5 min/次，高溫高壓抗原修復(fù)，滴加50 μl內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，37℃10 min，PBS沖洗3次 ×5 min;滴加非免疫性動(dòng)物血清，37℃10 min;棄去非免疫性動(dòng)物血清;滴加一抗VEGFR-3、CD31(皆為1∶100稀釋工作液)，4℃過夜，PBS洗3次×5 min;滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次×5 min;滴加50 μl鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37℃孵育30 min，PBS洗3 次 ×5 min;滴加 100 μl新鮮配制的 DAB 溶液，顯色5～10 min;自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。PIPS-2020超清晰度病理圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)平均光密度。PBS替代一抗作為空白對(duì)照。

作者單位:421001 衡陽，南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院(陳艷明 嚴(yán)加林);南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(封萍)

1.3 結(jié)果判定 VEGF以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒計(jì)為陽性細(xì)胞。參照 Zhong等［2］的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，每例標(biāo)本選取5個(gè)(×200)高倍鏡視野計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野中陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量計(jì)數(shù)分級(jí):＞10%即為陽性。CD31結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按Weidner［3］報(bào)道的方法進(jìn)行:每張切片均在200倍視野下選取3個(gè)血管數(shù)目最多的視野，計(jì)數(shù)血管數(shù)，計(jì)算其平均數(shù)(MVD)。微血管的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:凡著色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，無論血管腔隙大小，均以其斷面多少來計(jì)數(shù)(厚壁血管除外)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCC中 VEGF蛋白的表達(dá)與定位 VEGF以內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞膜的棕黃色顆粒狀染色為主，偶見細(xì)胞核染色。VEGF在皮膚鱗癌組織中陽性表達(dá)較正常皮膚組高，兩者差異有顯著性(P＜0.05)。見表1。

2.2 SCC中CD31蛋白的表達(dá) CD31是一種內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子，可在多數(shù)腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，與腫瘤新生血管的形成亦密切相關(guān)。CD31陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和胞膜的棕黃色顆粒狀染色，可較好的反映出腫瘤中的MVD情況。正常皮膚組織中MVD值為19.83，在I～Ⅱ期鱗癌組織中MVD值為38.46，在Ⅲ～Ⅳ期鱗癌組織中MVD值為48.35。各病變組與正常皮膚組織相比均有顯著差異(P＜0.05)。見表2。

表1 VEGF免疫組化染色結(jié)果

表2 MVD-CD31在各組皮膚組織中的表達(dá)(±s)

表2 MVD-CD31在各組皮膚組織中的表達(dá)(±s)

注:*與正常皮膚組織比較，P＜0.05

組別 例數(shù) 陽性例數(shù)(%) MVD值 P值正常皮膚組織 20 20(100)19.83±2.59Ⅰ～Ⅱ期 20 20(100) 38.46±4.79 ＜0.05*Ⅲ～Ⅳ期 20 20(100) 48.35±5.01 ＜0.05*

3 討論

腫瘤的生長(zhǎng)離不開其相關(guān)血管的建立，血管的存在不僅可以滿足腫瘤所需的氧份，也是實(shí)現(xiàn)對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的必備條件［4］。同時(shí)在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中新生血管形成起極其重要的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是目前所知的作用最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子，與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，已在多種腫瘤研究中被證實(shí)是高表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤發(fā)展進(jìn)程呈正相關(guān)［5］。因此，VEGF在腫瘤患者體內(nèi)的表達(dá)可反映機(jī)體的腫瘤負(fù)荷情況，與腫瘤的大小、進(jìn)展及分化程度、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)和血源轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及術(shù)后生存期密切有關(guān)，對(duì)于腫瘤生物學(xué)行為、病情進(jìn)展和治療成效等方面的判斷具有重要價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚SCC中VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于正常皮膚對(duì)照組的表達(dá)，這與Bowden等［6］的研究結(jié)果相一致。

CD31是內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子，主要由內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴結(jié)中分化期的單核細(xì)胞分泌，可在多數(shù)腫瘤組織的血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，也與腫瘤新生血管的形成相關(guān)，反映了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲特征。CD31被認(rèn)為是目前血管內(nèi)皮細(xì)胞的最好方法之一。許多學(xué)者認(rèn)為在一些腫瘤組織如肺癌、食管癌及肝癌，CD31有較高的表達(dá)率［7］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色檢測(cè)CD31的表達(dá)，并通過計(jì)算MVD(微血管密度)比較各組皮膚組織中的表達(dá)差異。結(jié)果表明，CD31在正常皮膚組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，隨著皮膚鱗癌分期數(shù)的增加，CD31的陽性表達(dá)明顯升高，與分期密切相關(guān)。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)VEGF在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)和MVD具有相關(guān)性，VEGF高表達(dá)者中，MVD亦高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了VEGF與血管生成的密切關(guān)系。通過檢測(cè)VEGF及CD31蛋白的表達(dá)程度可能可以反映皮膚鱗癌的分期程度。

［1］趙辨.臨床皮膚病學(xué).江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2001:1123-1125．

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The expression of VEGF and CD31 in skin squamous cell carcinoma

CHEN Yan-ming，F(xiàn)ENG Ping，YAN Jia-lin.The Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China

ObjectiveTo investigate the expression of VEGF and CD31 and the relationship with the development in skin squamous cell carcinoma(SSCC).MethodsThe expression of VEGF and CD31 in normal human epidermis and SSCC were detected by immunohistochemistry staining method.ResultsVEGF and CD31 proteins were abnormally increased in SSCC as compared with normal human epidermis.Expressions of VEGF and CD31 in SSCCⅠ～Ⅱstages were also significantly higher than those in SSCCⅢ～Ⅳstages．ConclusionThe expression of VEGF and CD31 may play an important role in the pathogenesis of SSCC．

Skin squamous cell carcinoma;Immunohistochemistry staining method;VEGF;CD31