徐洪偉，賀 飛

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱150086）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以漿細(xì)胞異常增生為特征的一種惡性腫瘤疾病，占血液系統(tǒng)腫瘤的10%、全身惡性腫瘤的1%［1］。好發(fā)于中老年人，近年來(lái)由于我國(guó)人口老齡化及人們對(duì)該病的認(rèn)識(shí)水平提高，該病發(fā)病率有逐漸增加趨勢(shì)。染色體異常是MM預(yù)后的重要指標(biāo)，而常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)操作繁瑣，周期長(zhǎng)，干擾因素多，準(zhǔn)確性和特異性欠佳，只有約3%的患者檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)治療反應(yīng)的判斷及微小殘留病灶的檢測(cè)較為困難。隨著熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）、光譜核型分析（spectral karyotyping，SKY）等細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MM細(xì)胞遺傳學(xué)研究領(lǐng)域有較大進(jìn)展。本研究采用I－FISH 技術(shù)，應(yīng)用D13S319特異性探針，探討 MM患者的細(xì)胞遺傳學(xué)異常與臨床特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1．1 標(biāo)本收集 2005－2009年我院確MM診病例64例，男44例，女20例，年齡34－85歲，中位年齡62歲；符合國(guó)內(nèi)MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，確診前均未接受過(guò)化療和其他特殊治療。I－FISH對(duì)照組選用同期10例非血液系統(tǒng)惡性疾病核型正?；颊摺?/p>

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 免疫固定電泳采用美國(guó)Helena公司全自動(dòng)快速電泳分析系統(tǒng)（Rapid Eleetrophoresis，REP），重鏈IgG、IgA、IgM和輕鏈κ、λ進(jìn)行免疫電泳后，與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物被固定，然后進(jìn)行染色、洗脫、掃描等。

1．2．2 免疫球蛋白定量采用美國(guó) Beckman－Cou1ter IMMAGE免疫化學(xué)分析儀，以速率散射比濁法定量測(cè)定。

1．2．3 試劑 免疫固定電泳均用Helena公司生產(chǎn)的試劑盒。免疫球蛋白定量使用美國(guó)Beckman－Coulter公司生產(chǎn)的試劑盒。

1．2．4 常規(guī)核型分析 取肝素抗凝骨髓，先行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×106－2×106／ml的密度注入10ml培養(yǎng)液，加有絲分裂原刺激劑PHA72小時(shí)，于終止培養(yǎng)前2－4小時(shí)加入秋水仙素終止中期分裂相后常規(guī)染色體標(biāo)本制備。制備的染色體標(biāo)本保存于－20℃，采用氣干法滴片，Giemsa液染色，在顯微鏡下觀察50個(gè)中期分裂相，核型描述依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN1995）》。

1．2．5 間期熒光原位雜交（interphase fluorescence in situ hybridization，I－FISH）探針 檢測(cè)探針為針對(duì)13q14缺失的探針（D13S319），購(gòu)自基因有限公司。（1）玻片制備：骨髓細(xì)胞懸液氣干法滴片，在室溫下過(guò)夜老化；將玻片在37℃新鮮配制的RNase A溶液中孵育30min，室溫放置30min；室溫下于2×SSC（pH7．0）溶液中漂洗玻片2次，依次置于室溫的70%、85%和100%乙醇中梯度脫水，自然干燥玻片。（2）變性雜交：玻片在74℃ 變性液（70%甲酰胺／2×SSC）中變性5min后在乙醇中梯度脫水，自然干燥；置于46℃烤片機(jī)上等待雜交；將10μl探針混合物（按照探針∶去離子水∶雜交緩沖液為2∶1∶7的比例混合）于74℃水浴中變性5min，46℃水浴10－15min后滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊；將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42℃溫箱中過(guò)夜雜交。（3）玻片洗滌：移去蓋玻片，置于65℃0．4×SSC／0．3%NP－40 洗滌液中洗滌 2 min，在室溫0．1%NP－40／2×SSC洗液洗滌1min，取出后暗處自然干燥，（4）熒光顯微鏡觀察：每份標(biāo)本加10μl DAPI復(fù)染，用蓋玻片封好后置于暗盒中10－20min后，用熒光顯微鏡觀察間期細(xì)胞熒光雜交信號(hào)數(shù)目。每個(gè)探針計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，用Isis－FISH圖像軟件采集圖像。

1．2．6 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè) 采空腹靜脈血，分離取血清，應(yīng)用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動(dòng)生物化學(xué)分析系統(tǒng)，速率法340nm測(cè)定LDH活性，＞250U為異常。

1．2．7 β2微球蛋白（β2－microglobulin，β2－MG）檢測(cè)應(yīng)用Hitarchi全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)，免疫比濁法測(cè)定β2－MG含量。

1．2．8 白蛋白檢測(cè)（albumin，ALB）采靜脈血，分離心血清，應(yīng)用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動(dòng)生物化學(xué)分析系統(tǒng)，溴甲酚綠法測(cè)定。

1．2．9 血肌酐（Creatinine，CRE）檢測(cè) 采靜脈血，分離血清，應(yīng)用 BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動(dòng)生物化學(xué)分析系統(tǒng)，苦味酸法測(cè)定。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件采用χ2、Fisher’s確切概率法檢驗(yàn)分析MM患者中13號(hào)染色體缺失與13號(hào)染色體正常組之間 LDH、Creatinine、β2－MG、ALB的差異。應(yīng)用Kaplan－Meier方法繪制生存曲線。用Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析，找出影響總體生存的預(yù)后因素。P＜0．05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2．1 64例MM患者一般資料 見(jiàn)表1。

表1 例64MM患者臨床特征

2．2 常規(guī)染色體核型分析及I－FISH檢測(cè)結(jié)果64例MM患者進(jìn)行常規(guī)染色體核型8例（13%）未收獲淋巴細(xì)胞，56例獲得中期分裂相，其中13號(hào)染色體缺失28例（44%）（見(jiàn)表1）。傳統(tǒng)核型分析中8例異常，其中13q－2例（與I－FISH結(jié)果一致），亞二倍體2例，t（11；14）（q13；q32）1例，7q－2例，超二倍體1例。

2．3 13號(hào)染色體缺失與13號(hào)染色體正常組生存差異與相關(guān)因素分析 將13號(hào)染色體缺失與13號(hào)染色體正常兩組患者采用 Kaplan－Meier法評(píng)估生存曲線，13號(hào)染色體正常組患者生存時(shí)間長(zhǎng) （P＝0．036）。將可能影響生存的因素如性別、年齡、白蛋白等進(jìn)行Cox逐步回歸分析，結(jié)果顯示在排除β2－MG、Creatinine、白蛋白、血紅蛋白的影響條件下，13號(hào)染色體完整性是影響生存時(shí)間的獨(dú)立因素，13號(hào)染色體正常組患者生存時(shí)間長(zhǎng)（見(jiàn)圖1）。在排除13號(hào)染色體的影響后，β2－MG對(duì)生存時(shí)間有影響，β2－MG值越高，生存時(shí)間越短，低β2－MG患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)降低了59．82% （95%C I：0．14～0．59，P＝0．041）。13號(hào)染色體缺失與13號(hào)染色體正常兩組患者在疾病進(jìn)展方面存在顯著差異（P＝0．042）。

圖1 13號(hào)染色體缺失與正常組患者生存曲線

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是惡性漿細(xì)胞病中最常見(jiàn)的一種類型，又稱骨髓瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤，其病理機(jī)制尚未闡明，預(yù)后與 MM患者的血紅蛋白、肌酐、Ca2＋和M蛋白、免疫分型及骨髓漿細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)。

常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)由于骨髓漿細(xì)胞在體外的有絲分裂指數(shù)低下而受到限制，即使獲得足夠的中期分裂相，有些染色體異常仍然檢測(cè)不到，通常只有1／6左右的患者核型分析結(jié)果陽(yáng)性。常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)可以檢測(cè)到的染色體異常通常為10－12Mb大小。I－FISH 技術(shù)通過(guò)檢測(cè)DNA探針與MM患者染色體異常所在靶區(qū)域的特異性結(jié)合（通常20－50Kb），對(duì)于染色體數(shù)目異常檢測(cè)的敏感性明顯優(yōu)于常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)［3］，且同時(shí)適用于分裂期和間期細(xì)胞，可以鑒別出很小的突變區(qū)域［4］。幾乎所有的 MM患者均存在染色體異常，且多為復(fù)雜核型異常，其中以涉及1、14號(hào)染色體結(jié)構(gòu)異常和13號(hào)染色體的全部或部分缺失最為常見(jiàn)［5，6］。13號(hào)染色體缺失在漿細(xì)胞疾病中較為普遍，且存在于 MM 的各個(gè)階段，未見(jiàn)于正常人［5］。不同研究結(jié)果顯示 MM患者中13號(hào)染色體缺失發(fā)生率約26%－50%［5，3，7］。13號(hào)染色體缺失的最小缺失區(qū)仍未精確定位。目前認(rèn)為，染色體13缺失的致病主要經(jīng)由以下兩個(gè)途徑：（1）特定基因的單倍基因功能不全（例 GTF2F2，TSC－22和 RB1等）；（2）細(xì)胞周期基因的擴(kuò)增表達(dá)（例CCNB1，UBE2C等）［8，9］。其他與13號(hào)染色體缺失相關(guān)的分子水平改變還有：DNA修復(fù)缺陷、IGF1－IGF1R自分泌生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)路形成等，可能在發(fā)病過(guò)程中也具有重要作用［8］。對(duì)13號(hào)染色體缺失分子水平改變進(jìn)行深入研究，將為MM患者提供新的治療靶點(diǎn)。

本研究顯示，64例初診 MM患者中28例（44%）13號(hào)染色體缺失，并且與β2－MG水平升高呈正相關(guān)，提示細(xì)胞遺傳學(xué)異常與MM患者的腎功能衰竭等臨床特征有內(nèi)在聯(lián)系。13號(hào)染色體缺失組患者生存時(shí)間縮短，提示13號(hào)染色體缺失與MM的疾病進(jìn)展、侵襲性病程、生存期縮短及預(yù)后關(guān)系密切。13號(hào)染色體缺失可以為MM的評(píng)估預(yù)后提供可靠依據(jù)。

綜上所述，13號(hào)染色體缺失在 MM的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要的作用，13號(hào)染色體缺失檢測(cè)可用于MM患者的臨床狀態(tài)、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷。

［1］J Robert A Kyle，Jerry A Katzmann，John A Lust，et al．Mannual of clinical laboratory immunology．sixth edition［M］．USA：ASM PRESS，2002．66－70．

［2］張之南，沈 悌．血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)［M］．第2版．北京：科學(xué)出版社，1998．373－374．

［3］Facon T，Avet－Loiseau H，Guillerm G，et al．Chromosome 13abnormalities identified by FISH analysis and serumβ2－microglobulin produce a very powerful myeloma staging system for patients receiving high dose therapy［J］．Blood，2001，97（6）：1566．

［4］郭 力，李文君，侯 明，孫建芝，等．間期熒光原位雜交檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤并臨床分析［J］．臨床血液學(xué)雜志，2010，23（9）：523．

［5］Shaughnessy J，Tian E，Sawyer J，et al．High incidence of chromosome 13deletion in multiple myeloma detected by multiprobe interphase FISH［J］．Blood，2000，96（4）：1505．

［6］H ARRISON C J，MAZZULLO H，CHEUNG K L，et al．Cytogenetics of multiple myeloma：interpretation of fluorescene in situ hybridization results［J］．Br JH aematol，2003，120：944．

［7］Chromosome 13abnormalities identified by FISH analysis and serumβ2－microglobulin produce a powerful myeloma staging system for patients receiving high－dose therapy．

［8］Shaughnessy J，Jacobson J，Sawyer J，et al．Continuous absence of metaphase－defined cytogenetic abnormalities，especially of chromosome 13and hypodiploidy，ensures longterm survival in multiple myeloma treated with total therapy I：interpretation in the context of global gene expression［J］．Blood，2003，101（10）：3849．

［9］Fonseca R，Harrington D，Oken M M，et al．Biological and prognostic significance of interphase fluorescence in situ hybridization detection of chromosome 13abnormalities（delta13）in multiple myeloma：an Eastern Cooperative Oncology Group study［J］．Cancer Res，2002，62（3）：715．