李建業(yè)，劉運周，張 薇，王超要，胡衛(wèi)紅

（中國人民解放軍第四二一醫(yī)院 檢驗輸血科，廣東 廣州510318）

北沙參為常用中藥，2010版《中華人民共和國藥典》收載為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr．Schmidt ex Miq．的干燥根［1］，其化學成分豐富，類型復雜，具有鎮(zhèn)咳祛痰、抗菌、抗癌和滋陰補虛等藥理作用［2］。目前對北沙參的相關研究主要集中在栽培種植技術和化學成分鑒定分離分析等方面［3－4］，但對北沙參化學成分的藥理活性及兩者之間的關聯(lián)方面缺乏深入的研究，因此，我們通過對北沙參進行深入的化學成分及藥理活性研究，希望能尋找其具有相關療效的有效成分，從而使北沙參更好地發(fā)揮其藥用價值。

1 材料和方法

1．1 材料

動物：Balb／c小鼠，18－22g，雌雄各半，均由本院實驗動物中心提供。藥品及器材：細胞培養(yǎng)基RPMI 1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青公司；CCK－8試劑盒：日本同仁化學研究所，CK04；不銹鋼細胞篩、手術刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗等手術器械（均需經(jīng)消毒處理）購自晶普醫(yī)療器械有限公司；注射器、燒杯、PBS（自配，高壓蒸汽滅菌后使用）和環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號008526）；北沙參（自制成不同濃度，至4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

1．2 方法

1．2．1 動物分組及給藥 取50只Balb／c小鼠隨機分為5組：陰性對照組（生理鹽水）、陽性對照組（環(huán)磷酰胺）、北沙參1g·kg－1組、北沙參2．0g·kg－1組和北沙參4．0g·kg－1組，每組10只動物。北沙參各劑量組每天0．2ml灌胃給藥1次，連續(xù)給藥10d。陽性對照組以100mg·kg－1劑量給動物腹腔注射環(huán)磷酰胺1次。

1．2．2 臟器指數(shù)的計算 分組及給藥見1．2．1。于末次給藥24h后，稱量各組小鼠體重，脫頸椎處死小鼠，迅速取出完整脾臟和胸腺，修去脂肪、系膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算臟器指數(shù)。胸腺（脾）指數(shù)＝胸腺（脾）重 （mg）／體重（g）。

1．2．3 小鼠腹腔巨噬細胞的制備［5］頸椎脫臼法處死小鼠，70%乙醇浸泡5min；預冷PBS注射，使注入的液體散布于整個腹腔；腹膜上剪開一小口，迅速用注射器通過開口插入腹腔內(nèi)吸出細胞懸液。

巨噬細胞的純化：細胞懸液離心10min后棄上清，培養(yǎng)液重懸細胞，放入CO2培養(yǎng)箱中2h。取出培養(yǎng)瓶，除去未貼壁的細胞。瓶中已貼壁的細胞主要是巨噬細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后換液，得到接近純凈的巨噬細胞。

北沙參對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的測定：將從上述各組小鼠腹腔分離純化后的巨噬細胞置于CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄上清，每孔加入0．1%的中性紅溶液，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出，棄中性紅。PBS清洗96孔培養(yǎng)板3次，棄上清。加入細胞裂解液，靜置過夜，570nm波長下測定OD值（630nm為校正波長）。

1．2．4 小鼠脾淋巴細胞的制備［6］脾淋巴細胞的獲?。侯i椎脫臼法處死小鼠，70%乙醇浸泡5min，剪開小鼠胸腔，取出脾臟置于培養(yǎng)皿中，Hank’s液漂洗。粗剪脾臟成小塊，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上，輕輕擠壓，收集濾過的細胞懸液，加入消化緩存液除去血紅細胞。將上述收集到的脾臟細胞置于含培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2h，除去貼壁細胞，收集未貼壁的細胞懸液即獲得接近純化的脾臟淋巴細胞，計數(shù)接種培養(yǎng)。

北沙參對小鼠脾淋巴細胞殺瘤活性的影響（CCK－8法）［7］：取事先配好的靶細胞懸液加入96孔板，于CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2h。之后取1．2．1中不同處理組的小鼠脾淋巴細胞加入96孔板，按效靶比20∶1加入，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后加入10μl CCK－8溶液。培養(yǎng)4h，測定波長450nm，校正波長600nm，計算殺傷率，公式如下：

1．2．5 小鼠自然殺傷細胞的制備［8］小鼠脾臟NK細胞的獲得：頸椎脫臼法處死小鼠，70%乙醇浸濕小鼠全身。超凈工作臺內(nèi)取出脾臟置于不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，100目不銹鋼篩網(wǎng)上研磨至單個細胞，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后，離心5min。棄上清，加入消化緩存液以除去血紅細胞。加入0．4ml生理鹽水，離心5min，細胞沉淀重懸于培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度。取事先配好的靶細胞懸液加入96孔板，于CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2h后加入NK細胞，CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)過夜。棄上清，輕洗每孔3次，加入0．1%的中性紅溶液，37℃，30 min。棄染液，輕洗每孔3次，加入細胞溶解液，492 nm測定吸光度值，公式如下：

1．3 統(tǒng)計學處理

使用EXCEL軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，t－test及三組以上（單因素 One－way）或者兩組之間（兩因素 Twoway）方差分析進行統(tǒng)計學分析，P＜0．05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 北沙參對小鼠免疫器官重量的影響

與正常對照組相比，環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟、胸腺重量顯著降低；與環(huán)磷酰胺 組相比，北沙參組小鼠胸腺、脾臟重量明顯高于環(huán)磷酰胺組，見表1。

表1 北沙參對小鼠免疫器官重量的影響（ˉx±s，n＝10）

2．2 北沙參對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

小鼠連續(xù)灌胃給予不同濃度的北沙參溶液，巨噬細胞吞噬中性紅的能力見表2，在低、中、高劑量組北沙參可以增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力。

表2 北沙參對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響（ˉx±s，n＝10）

2．3 北沙參對小鼠淋巴細胞抑瘤活性的影響

北沙參1g·kg－1、2g·kg－1和4g·kg－1對小鼠淋巴細胞的殺瘤率分別為20．76%、28．47%和36．61%，見表3。

表3 北沙參對小鼠脾淋巴細胞殺瘤活性的影響（xˉ±s，n＝10）

2．4 北沙參對小鼠脾臟NK細胞殺傷能力的影響

北沙參1g·kg－1、2g·kg－1和4g·kg－1對小鼠自然殺傷細胞的殺傷率分別為20．58%、27．64%和38．37%，結(jié)果見表4。

表4 北沙參對小鼠脾臟自然殺傷（NK）細胞的影響（ˉx±s，n＝10）

3 討論

北沙參含有揮發(fā)油、香豆素、淀粉、生物堿、三萜酸、豆甾醇、各甾醇，沙參素等成分，可增強正氣，減少疾病，預防癌癥的產(chǎn)生［10］。

作為機體重要免疫器官的胸腺和脾臟，其臟器系數(shù)是衡量機體免疫功能的初步指標。單核巨噬細胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細胞類型—巨噬細胞，其由血液中單核細胞遷入組織后分化而成，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應性免疫的專職抗原提呈細胞。單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一，當細菌、異物等抗原性物質(zhì)進入機體后，可迅速被單核巨噬細胞吞噬和清除。本文采用體內(nèi)給藥，體外分離純化巨噬細胞，測定巨噬細胞對中性紅的吞噬能力。淋巴細胞由淋巴器官產(chǎn)生，是機體免疫應答功能的重要細胞成分，成熟淋巴細胞需依賴抗原刺激而分化增殖，繼而發(fā)揮其免疫功能。自然殺傷細胞是機體重要的免疫細胞之一，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關，活化的自然殺傷細胞可合成和分泌多種細胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫、造血和直接殺傷靶細胞等作用。

實驗證明，北沙參組可以增加小鼠胸腺、脾臟重量，增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力，提高小鼠淋巴細胞的殺瘤率和自然殺傷細胞的殺傷能力。其相關具體機制有待進一步研究。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010．92．

［2］成文娜，郭承軍，石俊英．北沙參近十年的研究進展［J］．齊魯藥事，2008（27）：734．

［3］時新剛，李淑娥，孫慶雷，等．北沙參的1HNMR指紋圖譜研究［J］．山東科學，2009（22）：24．

［4］舒春清，郭 杰，石玉文，等．北沙參栽培技術與繁種方法［J］．實用技術，2005（12）：36．

［5］薛慶善．體外培養(yǎng)的原理和技術［M］．北京：科學出版社，2001．30－38．

［6］鄂 征．組織培養(yǎng)技術［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1982．245－289．

［7］陳 奇．中藥藥理研究方法學［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006．748－752．

［8］陳 奇．中藥藥理研究方法學［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006．755－760．

［9］陳 奇．中藥藥理研究方法學［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006．749－754．

［10］辛 華，雨 龍．北沙參的生物學與化學成分的研究進展［J］．中草藥，2008，（8）：1275．