李 丹，荊 蕾，丁 會(huì)

（吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021）

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌發(fā)生率的3／4，手術(shù)是Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者的最佳治療手段。但在我國(guó)，大多數(shù)NSCLC就診時(shí)已是中晚期，同時(shí)，Ohta等于2006年報(bào)道［1］，腫瘤直徑≥5cm的Ib期NSCLC完全切除后的中位無(wú)病生存期僅為9個(gè)月，術(shù)后1年的復(fù)發(fā)率高達(dá)56．8%，提示根治術(shù)后有必要進(jìn)行輔助化療。因此，內(nèi)科治療仍是肺癌的主要治療方法。但近十年來(lái)，以鉑類化療為主的治療手段并未使NSCLC的療效獲得突破性進(jìn)展，20世紀(jì)90年代以來(lái)分子靶向治療雖然療效卓越［2］，但由于受基因型及昂貴費(fèi)用的限制，也無(wú)法得到廣泛的推廣。本課題組擬在發(fā)現(xiàn)有機(jī)汞具有多途徑抗癌效應(yīng)的基礎(chǔ)上［3］，進(jìn)一步探討無(wú)機(jī)汞對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，以期為NSCLC治療開(kāi)辟新的治療途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 體外實(shí)驗(yàn)

1．1．1 材料 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系由王曉軍博士贈(zèng)送，本實(shí)驗(yàn)室凍存。氯化汞（MC）為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，F(xiàn)ACSAN流式細(xì)胞儀（Flowcytometry，F(xiàn)CM）由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1．1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞復(fù)蘇后以含10%小牛血清、100U／ml青霉素，100U／ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（高糖）于37℃，5%CO2和100%飽和濕度培養(yǎng)，用0．25%胰酶消化，每3～4d換液傳代1次。

1．1．3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用 MTT比色法。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、氯化汞組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，以2×105／ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔190μl，培養(yǎng)12h，待細(xì)胞完全貼壁后棄去培養(yǎng)液，分別加入終濃度為40、20、10、5、2．5pmol／L的氯化汞（10μl／孔）。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白（僅加培養(yǎng)液）對(duì)照組。加藥后送回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72h后，每孔加入20ulMTT液（5mg／ml），4h后，1 000r／min離心5min，棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，振蕩10 min，使 MTT還原產(chǎn)物完全溶解，DG－3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔光密度（A）值，波長(zhǎng)定于570 am，計(jì)算增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值／對(duì)照組平均吸光度值）×10%。

1．1．4 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)密度及形態(tài)變化

將接觸氯化汞不同濃度、不同時(shí)間的各組細(xì)胞置于倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度及形態(tài)變化，并攝片，放大倍數(shù)為100倍。

1．1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用多因素有重復(fù)數(shù)據(jù)的方差分析（Mutiple ANOVA）及Tukey兩兩比較方法。

1．2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1．2．1 實(shí)體瘤模型的制備 將2×106個(gè)Lewis細(xì)胞注射于C57BL／6純系小鼠（6－8周齡，18－22g，雌雄各半，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）右下肢后外側(cè)皮下，共注射30只，30天后，選出瘤體直徑達(dá)5 mm的小鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）和實(shí)驗(yàn)組（10只）。

1．2．2 腫物體積測(cè)量及病理組織細(xì)胞觀察 實(shí)驗(yàn)組裸鼠每次灌胃給于10ng／kg MC，隔日1次，共5次；對(duì)照組以相同途徑給于相同體積的生理鹽水。停藥后觀察1周，全部處死各組小鼠，再測(cè)量腫物長(zhǎng)短徑，腫瘤體積以長(zhǎng)徑×短徑2×0．5236計(jì)算［4］。取瘤組織置于10%福爾馬林中固定，制備病理組織學(xué)切片，HE染色觀察組織細(xì)胞改變。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSSl0．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0．05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 氯化汞對(duì)小鼠Lewis肺癌的增殖抑制作用

氯化汞對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制作用，A570值與對(duì)照組比具有顯著性差異，且隨著濃度的增加，逐漸變小，說(shuō)明增殖抑制作用存在著劑量依賴性；48、72h后，A570值下降幅度進(jìn)一步加大，說(shuō)明增殖抑制作用存在著時(shí)間依賴性。即氯化汞對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用存在著時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系，而且同一時(shí)間各濃度之間、同一濃度各時(shí)間之間均存在顯著性差異（P＜0．001），見(jiàn)表1。

表1 MC各濃度組不同時(shí)間點(diǎn)A570值和細(xì)胞增殖抑制率（n＝3，ˉx±s，%）

2．2 倒置光學(xué)顯微鏡下各組小鼠Lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)密度及形態(tài)變化

對(duì)照組細(xì)胞貼壁好，生長(zhǎng)密集。氯化汞組隨藥物濃度的增高，均可見(jiàn)圓形、漂浮于培養(yǎng)液中的細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。

2．3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2．3．1 荷瘤鼠給藥后的一般情況和腫瘤體積的變化 小鼠Lewis移植瘤模型給藥后活動(dòng)正常，未見(jiàn)活動(dòng)遲緩及四肢肌力降低，其活動(dòng)表現(xiàn)同生理鹽水對(duì)照組。

2．3．2 荷瘤鼠處死后，剝離瘤體，見(jiàn)腫瘤呈分葉狀，被膜大多較完整，少數(shù)與局部粘連。結(jié)果見(jiàn)MC明顯抑制體內(nèi)Lewis細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 氯化汞對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤鼠腫瘤體積增長(zhǎng)的抑制作用（ˉx±s）

2．3．3 HE染色形態(tài)學(xué)觀察Lewis腫瘤組織病理學(xué)改變 對(duì)照組Lewis細(xì)胞豐富密集，壞死很少。治療組Lewis細(xì)胞生長(zhǎng)密度較對(duì)照組降低，細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組減少，壞死增多，并可見(jiàn)到細(xì)胞收縮，體積變小，核固縮，藍(lán)色深染的凋亡形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞。

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在逐年上升，現(xiàn)已經(jīng)躍居各種惡性腫瘤的第一位。其中非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療不敏感，尤其引人重視。自發(fā)現(xiàn)順鉑具有抗癌作用以來(lái)，NSCLC的治療有所改觀［5］，金屬抗癌藥物的研究隨之引起了人們的廣泛興趣。目前，國(guó)內(nèi)外均有研究證實(shí)，氯化汞誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于As2O3［6］，對(duì)惡性度高、極易全身轉(zhuǎn)移的小細(xì)胞肺癌治療更具合理性。我們?cè)谝酝芯抗拘宰饔没A(chǔ)上，也證實(shí)汞制劑具有誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，且其能力強(qiáng)于As2O3［7］。

本文進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了氯化汞對(duì)NSCLC細(xì)胞及瘤體的增殖抑制作用。結(jié)果表明，氯化汞對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制作用，且該作用存在著時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，氯化汞在機(jī)體內(nèi)對(duì)腫瘤仍然有較明顯的增殖抑制作用。氯化汞抑制小鼠Lewis肺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與干擾細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了人肺癌裸小鼠移植瘤模型來(lái)檢測(cè)氯化汞體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。這種人腫瘤異種移植模型的優(yōu)點(diǎn)是：腫瘤仍保持其原有的藥物敏感性，其化療反應(yīng)性與臨床病人有較好的相關(guān)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組治療前后腫瘤體積測(cè)量，結(jié)果顯示，氯化汞治療組產(chǎn)生了明顯的抑瘤效果（P＜0．01）。同時(shí)可見(jiàn)裸鼠活動(dòng)正常，未見(jiàn)活動(dòng)遲緩及四肢肌力降低。由此可以初步推斷所給劑量及給藥方式對(duì)裸鼠的毒副作用小。因此，氯化汞對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞是敏感的，能促進(jìn)其死亡，抑制其增殖。

［1］Ohta Y，Shimizu Y，Minato H，et al．Results of initial operations in non－small cell lung cancer patients with single－level N2disease［J］．Ann Thorac Surg，2006，81（2）：427．

［2］曲怡梅，廖國(guó)清，劉鵬輝．吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的臨床研究［J］．Modern Oncology，2012，20（4）：735．

［3］丁 會(huì)，許力軍，李 丹．氯化甲基汞對(duì)小細(xì)胞肺癌NCI．H446細(xì)胞的增殖抑制作用［J］．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009，25（12）：1085．

［4］Sawaoka H，Tmji S，Tsujii M，et al．Cyclooxygenase inhibitors sup－press angiogenesis and reduce tumor growth in vivo［J］．lab Invest，1999，79（12）：1469．

［5］Ogasawara T，Kasamatsu N，Umezawa H，et al．Retrospective analysis of pemetrexed plus cisplatin chemotherapy for elderly advanced non－small－cell lung cancer［J］．Gan To Kagaku Ryoho，2011，38（11）：1813．

［6］楊惠芬，李明勛，張 鵬．氯化汞、三氧化二砷及阿糖胞苷對(duì)K562和 HEL細(xì)胞株作用的比較［J］．臨床血液學(xué)雜志，2003，16（5）：243．

［7］丁 會(huì)，孫曉艷，呂曉紅．氯化汞對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞周期的影響［J］．吉林醫(yī)學(xué)，2008，29（23）：2184．