徐莉娟，代麗萍，王凱娟，張建營，王 鵬#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001

2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

乳癌是全世界范圍內(nèi)中年女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率為10% ～15%[1]。近年來我國乳癌的發(fā)病率明顯上升，從20世紀(jì)90年代初期已居女性惡性腫瘤之首。乳癌的發(fā)病以40～60歲的女性最為多見，近年來40歲以下的發(fā)病率逐漸升高。早期診斷是乳癌二級預(yù)防的核心內(nèi)容。乳腺位于體表，癌腫易通過患者自查以及各種檢查手段如紅外線掃描、數(shù)字X線檢查、B超檢查和磁共振成像掃描以及細(xì)針穿刺活檢等發(fā)現(xiàn)，使乳癌比其他腫瘤更易早期診斷。除此之外，腫瘤標(biāo)志物[2]檢測亦是目前早期診斷乳癌常用的方法之一。乳癌抗原(CA153)、癌胚抗原(CEA)等已被認(rèn)為是有價值的指標(biāo)，但實(shí)際應(yīng)用中單項(xiàng)指標(biāo)的準(zhǔn)確性并不理想。作者聯(lián)合檢測乳癌患者血清中多種腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)抗體的表達(dá)，探討TAA聯(lián)合檢測在乳癌早期診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 115例乳癌患者血清標(biāo)本均由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供(為到該院就診、經(jīng)組織病理學(xué)確診的乳癌患者)，153例正常人血清標(biāo)本均采集自到該院進(jìn)行健康體檢并證實(shí)無任何腫瘤相關(guān)疾患的健康成人。

1.2 主要試劑和儀器 14種TAA(CyclinE，CDK2，CyclinB1，CyclinD1，p16，p62，Imp1，Koc，cIAP，Survivin，p53，Calnuc，C-myc，RalA)為美國德克薩斯州大學(xué)生命科學(xué)系腫瘤免疫和腫瘤分子流行病學(xué)研究室提供，96孔酶標(biāo)板(美國 Gibco公司)，SUNRISE酶標(biāo)儀(美國Tecan公司)。

1.3 血清中TAA抗體抗原的檢測及結(jié)果判定采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[3]:各種抗原以0.5 g/L的稀釋度包被96孔板;一抗均按1∶100稀釋，PBS作為空白對照，每孔加100 μL，37℃孵育2 h，PBST洗板3次;二抗 HRP標(biāo)記的羊抗人 IgG(H+L)1∶4000 稀釋，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，洗板3次;DAB顯色液每孔100 μL，37℃避光反應(yīng)至充分顯色;終止液50 μL，在酶標(biāo)儀上讀取波長450 nm處的OD值，空白孔調(diào)零。結(jié)果判定:每份樣品血清做3孔，取平均值判斷結(jié)果，空白孔調(diào)零;選擇5個乳癌患者血清和5個正常人血清作為判斷每批ELISA試驗(yàn)之間可靠性的指標(biāo);所有檢測的正常人血清OD值的平均值加2個標(biāo)準(zhǔn)差為判斷臨界值[4]，高于此值為陽性，低于此值為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或四格表確切概率法處理數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 每種TAA抗體檢測結(jié)果及真實(shí)性評價 見表1。由表1可見，單個TAA檢測乳癌患者血清時，乳癌組與正常組TAA檢出的陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，檢測的靈敏度13.0% ～32.2%，其中CyclinE抗體的陽性率(32.2%)最高，Calnuc抗體的陽性率(13.0%)最低;正常人抗體陽性率較低，CyclinB1抗體的陽性率(3.9%)最高，cIAP抗體的陽性率(0.7%)最低。

2.2 不同TAA抗體組合的檢測結(jié)果 并聯(lián)試驗(yàn)診斷結(jié)果見表2。

表1 每種TAA抗體檢測結(jié)果及真實(shí)性評價

表2 不同TAA抗體組合的檢測結(jié)果

由表2可見，隨著抗原種類的增加，檢測的靈敏度逐漸增加，當(dāng)增加到8種抗原時，繼續(xù)增加抗原種類，不能提高檢測的靈敏度，反而降低特異度。因此，從14種抗原中篩選出8種抗原的并聯(lián)組合(Cyclin E，Koc，Imp1，cIAP，p62，p16，Cyclin B1 和Calnuc)為最佳組合，8種抗原聯(lián)合檢測的靈敏度從32.2%增加到72.2%，比單個抗原增加了40%，特異度僅從98.0%降低到91.5%，約登指數(shù)為0.637，陽性預(yù)測值為86.5%，陰性預(yù)測值為81.4%。

2.3 最佳組合檢測乳癌的評價 見表3。篩選出的8種TAA聯(lián)合檢測時，乳癌患者血清中TAA抗體陽性率明顯高于正常人群血清，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=115.796，P ＜0.001)，提示8 種 TAA 聯(lián)合檢測乳癌的臨床診斷價值較高，診斷結(jié)果與真實(shí)值之間中度一致[真實(shí)性評價:靈敏度=72.2%，特異度=91.5%，約登指數(shù)=0.637，陽性似然比=靈敏度/(1－特異度)=8.490，陰性似然比=(1－靈敏度)/特異度 =0.304，一致率 =83.2%，Kappa=0.650，陽性預(yù)測值 =86.5%，陰性預(yù)測值 =81.4%]。

表3 最佳組合檢測乳癌結(jié)果 例

3 討論

既往研究[5-6]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測一組精心挑選的抗原抗體可以提高腫瘤早期診斷的靈敏度，同時為使抗原抗體聯(lián)合檢測在臨床應(yīng)用中達(dá)到一定的真實(shí)性，不同類型的腫瘤可能需要不同的抗原抗體組合[3，7]，但至目前，國內(nèi)沒有關(guān)于 TAA 抗體在乳癌中應(yīng)用的相關(guān)報道。

該研究結(jié)果表明，單獨(dú)應(yīng)用一種抗原抗體檢測時靈敏度普遍偏低，最高不到33%，在乳癌診斷中沒有實(shí)際意義;隨著TAA組合抗原種類的增加，直到最后8種TAA的聯(lián)合檢測，診斷的靈敏度有明顯上升，達(dá)到72.2%，而特異度則無明顯下降，說明聯(lián)合檢測確實(shí)可以提高乳癌的陽性檢出率。

該研究中所采用的抗原組合并不包括目前國際腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域普遍認(rèn)可的與乳癌相關(guān)性較高的CA153和CEA，主要原因是CA153在乳癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期診斷的靈敏度分別只有10% ～15%、20% ～25%和30% ～45%，而且在正常人群、乳腺良性病變、慢性肝炎、免疫球蛋白病和其他腺癌等中也發(fā)現(xiàn)有CA153增高[8];CEA雖然是乳癌臨床監(jiān)測常用指標(biāo)，但它在乳癌復(fù)發(fā)診斷中的價值更大[9]。

綜上所述，在乳癌的早期診斷中聯(lián)合檢測多種TAA抗體具有一定的應(yīng)用價值，今后的研究重點(diǎn)應(yīng)該集中在鑒定和設(shè)計乳癌特異的TAA組合，從而建立一種新的乳癌早期體外非侵入性診斷技術(shù)。

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