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        哮喘小鼠肺和下丘腦組織中γ-氨基丁酸受體ARα的表達(dá)

        2012-10-08 05:50:56朱亞蕊劉劍波
        關(guān)鍵詞:下丘腦氣道哮喘

        朱亞蕊,劉劍波

        鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

        γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是哺乳動物重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛,也存在于氣道平滑肌細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞等周圍組織[1]。根據(jù)受體對激動劑和拮抗劑的敏感性,GABA受體可以分成 GABAAR、GABABR和GABACR 3種。GABAAR屬受體門控離子受體超家族,α亞單位在GABAAR復(fù)合物的組裝和功能中可能起主要作用[2]。GABAAR和GABA合成酶(GAD65/67)在支氣管上皮細(xì)胞中均有表達(dá),組成了完善的GABA系統(tǒng)。已有研究[3-4]表明,過敏性哮喘時(shí)GABA系統(tǒng)功能增強(qiáng),霧化吸入GABAAR拮抗劑可抑制哮喘氣道黏液分泌,抑制氣道重塑。氣道杯狀細(xì)胞增生是哮喘的主要病理特征,MUC5AC是在氣道杯狀細(xì)胞表達(dá)的一種主要黏蛋白,反映了氣道黏液分泌情況[5]。作者對哮喘小鼠肺組織和下丘腦內(nèi)GABAARα、肺組織中MUC5AC進(jìn)行了檢測,旨在從分子水平探討哮喘小鼠肺和腦組織中GABAARα的變化及其與氣道黏液分泌的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)分組 6周齡清潔級雌性BALB/C小鼠30只,購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心,體質(zhì)量(20±2)g,按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,對照組、哮喘組、地塞米松組,每組10只。實(shí)驗(yàn)第1天和第8天,哮喘組和地塞米松組小鼠腹腔注射卵蛋白(OVA)/Al(OH)3混合液 1 mL(含 OVA 1 mg和 Al(OH)3100 mg,OVA購于Sigma公司)致敏,從實(shí)驗(yàn)第15天開始以用10 g/L OVA霧化吸入30 min/d激發(fā),連續(xù)7 d。對照組致敏與激發(fā)均以生理鹽水代替,地塞米松組在激發(fā)前腹腔注射地塞米松1 mg/kg。

        1.2 標(biāo)本的采集和處理 末次激發(fā)后24 h,水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,將生理鹽水注入右心室沖洗2次以洗盡肺和腦內(nèi)血液。暴露胸腔,切取左肺葉近肺門組織,多聚甲醛固定5~6 h后,轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇,常規(guī)石蠟包埋切片備用。切取右肺葉迅速放入液氮中,速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩4蜷_顱腔,迅速取出全腦組織置于冰臺上,分離出下丘腦,一側(cè)放入甲醛,一側(cè)速凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 肺組織病理學(xué)觀察 取肺組織切片,常規(guī)HE染色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況。

        1.4 肺組織糖原(PAS)染色觀察 將肺組織切片放入高碘酸水溶液氧化5 min,蒸餾水浸洗后在Schiff液中浸泡10~20 min,蒸餾水洗后用無水乙醇脫水,中性樹脂封片,觀察。

        1.5 肺組織和下丘腦組織中GABAARα mRNA、肺組織中MUC5AC mRNA的檢測 根據(jù)GenBank中GABAARα、MUC5AC和GAPDH的基因序列設(shè)計(jì)引物。MUC5AC引物序列:上游 5’-CAGCCGAG GAGGGTTTGATCT-3’,下 游 5’-AGTCTCTCTC CGCTCCTCTCAAT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小 349bp。GABAARα 引物序列:上游 5’-TGGGAAGAA CAAATCTGTGG-3’,下 游 5’ -GTAGCCTTGGGT GAAGCAAT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小636 bp。GAPDH引物序列:上游 5’-TCTTGGGCTACACTGAGGAC-3’,下游 5’-CATACCAGGAAATGAGCTTGA-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小126 bp。取約100 mg組織標(biāo)本加液氮研磨后加入1 μL Trizol試劑(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司),參照說明提取總RNA,取4 μL逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2 μL cDNA為模板,行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,53℃(GABAARα和GAPDH)或52℃(MUC5AC)退火30 s,72℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán);72℃總延伸6 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶顯色,在紫外線投射儀下觀察電泳條帶,用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。以目的基因和β-actin擴(kuò)增條帶的灰度值之比表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

        1.6 肺和下丘腦組織中GABAARα蛋白的檢測采用免疫組化SP法。小鼠抗GABAARα單克隆抗體(按50倍稀釋)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司。切片常規(guī)脫蠟水化,微波抗原修復(fù),用體積分?jǐn)?shù)3%H2O2除去內(nèi)源性氧化酶,余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。GABAARα蛋白染色陽性信號為棕黃色顆粒。用彩色圖像分析系統(tǒng)測定5個(gè)200倍視野的光密度,取其平均值,表示目的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。3組肺和下丘腦組織中GABAARα蛋白和mRNA的表達(dá)量、肺組織中MUC5AC mRNA表達(dá)量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn),哮喘組肺與下丘腦組織中GABAARα mRNA表達(dá)、GABAARα蛋白表達(dá)及肺組織中GABAARα與MUC5AC mRNA表達(dá)的關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

        2 結(jié)果

        2.1 3組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 對照組小鼠氣道黏膜正常,氣道周圍無炎性細(xì)胞浸潤,肺泡壁結(jié)構(gòu)完整;哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫,黏膜層增厚,支氣管壁及血管壁周圍有較多炎癥細(xì)胞浸潤;地塞米松組黏膜水腫及炎癥細(xì)胞浸潤較哮喘組減輕。見圖1。

        圖1 3組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE,×200)

        2.2 3組小鼠氣道PAS染色情況 對照組可見氣管及各級支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)完整,在纖毛間極少見杯狀細(xì)胞,肺泡大小正常。哮喘組、地塞米松組支氣管、亞段支氣管、細(xì)支氣管管壁可見大量染成紫紅色的杯狀細(xì)胞;支氣管黏膜上皮局部剝脫,黏膜下明顯水腫;黏膜層、黏膜下層及肌層有嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤;支氣管管腔內(nèi)分泌物增加,部分可見淋巴細(xì)胞。地塞米松組上述表現(xiàn)較哮喘組明顯減輕。見圖2。

        2.3 3 組小鼠肺組織中 GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白的表達(dá) 見圖3和圖4。肺組織中GABAARα蛋白主要表達(dá)于氣道上皮,在基底部無表達(dá),陽性表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜。哮喘組小鼠肺組織 GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白表達(dá)量較對照組增高,地塞米松組 較哮喘組明顯降低,但仍高于對照組(表1)。

        表1 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA及GABAARα蛋白的表達(dá)

        2.4 3組小鼠下丘腦組織中GABAARα mRNA和蛋白的表達(dá) 見圖3和圖5。GABAARα蛋白在下丘腦組織中主要表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)、胞膜和凸起,胞核無染色。哮喘組小鼠下丘腦組織中GABAARα mRNA和蛋白的表達(dá)較對照組明顯增高。地塞米松組小鼠下丘腦組織中GABAARα mRNA和蛋白的表達(dá)較哮喘組降低,但與對照組比較,兩者的表達(dá)水平仍較高(表2)。

        圖5 3組小鼠下丘腦GABAARα蛋白的表達(dá)(SP,×200)

        表2 3組小鼠下丘腦GABAARα mRNA和蛋白的表達(dá)

        2.5 哮喘組小鼠各指標(biāo)之間相關(guān)性分析 哮喘組小鼠肺組織GABAARα與MUC5AC mRNA的相對表達(dá)量呈正相關(guān)(r為 0.814,P=0.004)。哮喘組小鼠下丘腦與肺組織中GABAARα mRNA的相對表達(dá)量、蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r分別為0.740、0.791,P 分別為 0.014、0.006)。

        3 討論

        過敏性哮喘是有多種細(xì)胞和細(xì)胞成分參與的氣道慢性炎癥,發(fā)病機(jī)制不完全清楚。中樞神經(jīng)系統(tǒng)在哮喘發(fā)作中發(fā)揮重要作用,有學(xué)者[6]提出了哮喘發(fā)病的中樞致敏機(jī)制及中樞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。下丘腦是邊緣系統(tǒng)的重要核團(tuán),是免疫和應(yīng)激反應(yīng)的重要整合中樞[7],可直接或間接參與氣道張力和過敏反應(yīng)的調(diào)控[8]。作者觀察到,哮喘小鼠下丘腦GABAARα蛋白表達(dá)增強(qiáng),這就增加了GABA與其受體結(jié)合的機(jī)會,增強(qiáng)了GABA的抑制作用,表明GABA可能是參與哮喘病理生理過程的重要中樞性神經(jīng)遞質(zhì)之一,進(jìn)一步證實(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)在哮喘病理生理過程中發(fā)揮作用。哮喘小鼠腦組織中GABA受體增加的機(jī)制可能是:由于血清中增高的IL-13、IgE、IL-5等炎癥因子通過血腦屏障到達(dá)中樞系統(tǒng),或通過哮喘激發(fā)時(shí)由于缺氧或緊張導(dǎo)致神經(jīng)興奮上傳到中樞,使中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥因子增多,導(dǎo)致GABA受體增加。哮喘發(fā)作時(shí)機(jī)體處于一種應(yīng)激狀態(tài),下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)興奮,大腦興奮性神經(jīng)遞質(zhì)大量釋放,為平衡興奮性神經(jīng)遞質(zhì),抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA釋放亦增多,GABA受體表達(dá)上調(diào)是一種中樞神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

        氣道黏液過度分泌是重癥哮喘的特征之一。研究[9]表明 GABA系統(tǒng)和黏液分泌關(guān)系密切,阻斷GABAAR后能夠抑制哮喘急性發(fā)作期的黏液分泌和杯狀細(xì)胞增生。該研究結(jié)果表明,過敏性哮喘小鼠被OVA激發(fā)后氣道上皮細(xì)胞GABAAR mRNA表達(dá)增多,氣道杯狀細(xì)胞增生,MUC5AC mRNA表達(dá)亦增強(qiáng),兩者具有相關(guān)性。研究[10]證實(shí),GABAAR的運(yùn)輸及細(xì)胞表面靶作用由PI3K調(diào)節(jié),其可被不同的信號活化,包括胰島素、生長因子及白介素。哮喘患者T細(xì)胞可產(chǎn)生大量白介素如IL-4、IL-13、IL-5、IL-10等,這些白介素可能通過活化上皮細(xì)胞的PI3K/Akt通路激發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞后突觸區(qū)GABAAR[11],通過 GABA 引起氣道黏液的大量分泌。

        作者還觀察到,地塞米松組小鼠肺和腦組織中GABAARα、肺組織中MUC5AC的表達(dá)均較哮喘組低,說明地塞米松治療哮喘的機(jī)制包括抑制炎癥因子釋放,下調(diào)肺組織和腦組織GABA受體的表達(dá),減輕黏蛋白的分泌。哮喘小鼠下丘腦與肺組織中GABAARα的表達(dá)均呈正相關(guān),提示GABA系統(tǒng)可能與哮喘的中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)有關(guān),但肺和腦組織中GABA的具體信號傳導(dǎo)機(jī)制及腦內(nèi)其他神經(jīng)遞質(zhì)的變化還有待進(jìn)一步研究。

        [1]Fu XW,Wood K,Spindel ER.Prenatal nicotine exposure increases GABA signaling and mucin expression in airway epithelium[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2011,44(2):222

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        [3]徐傳芹,鄭玉龍,程偉.GABA和一葉秋堿對哮喘小鼠肺功能和黏液的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(23):3541

        [4]任旭斌,劉春濤,朱濤.荷包牡丹堿對哮喘小鼠肺組織α-SMA及氣道重構(gòu)的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,41(4):626

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        [9]劉劍波,張珍祥,徐永健,等.白細(xì)胞介素13對小鼠支氣管哮喘模型肺組織鈣激活的氯通道gob-5和黏蛋白基因MUC5AC表達(dá)的作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,27(12):837

        [10]Serantes R,Arnalich F,F(xiàn)igueroa M,et al.Interleukin-1beta enhances GABAA receptor cell-surface expression by a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway:relevance to sepsis-associated encephalopathy[J].J Biol Chem,2006,281(21):14632

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