趙 綺，劉林嶓#，李廣帥，張 晨

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科 鄭州 450052

2)鄭州大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔預(yù)防科 鄭州 450052

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)與皮膚基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)又被稱為非黑色素性皮膚癌，二者均起源于表皮或其附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞[1]，其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為內(nèi)皮細(xì)胞特異絲裂原直接參與腫瘤的血管生成，VEGF受體1(Flt-1)與VEGF受體2(KDR)是VEGF的糖基化跨膜受體，直接參與VEGF胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。VEGF及其受體Flt-1、KDR與腫瘤血管生成關(guān)系密切，不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞[2-4]。作者采用免疫組化染色方法檢測(cè)了皮膚SCC和BCC組織中VEGF、Flt-1和KDR蛋白的表達(dá)，探討非黑色素性皮膚癌的發(fā)病機(jī)制，以期為非黑色素性皮膚癌的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2007年3月至2009年3月確診為皮膚SCC和BCC的組織蠟塊。其中SCC 26例，患者中男16例，女10例，年齡37～77歲;BCC 18例，患者中男8例，女10例，年齡40～65歲。選擇同期皮瓣移植切除的正常皮膚組織標(biāo)本10例(男、女各5例)作對(duì)照。所有病例均有完整的病歷資料，無系統(tǒng)性疾病、皮膚疾病、結(jié)締組織病及重要臟器疾病史，術(shù)前無放療、化療等治療史。

1.2 VEGF、Flt-1和 KDR蛋白的檢測(cè) 標(biāo)本均3～4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，采用免疫組化SP法檢測(cè)VEGF、Flt-1和KDR蛋白。SP9000試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。高溫?zé)嵝迯?fù)組織抗原，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，用正常血清(按10倍稀釋)封閉組織內(nèi)非特異抗原;滴加一抗(均為兔抗人多克隆抗體，美國 Santa Cruz，按100倍稀釋)，溫育1 h后取出，4℃過夜，PBS沖洗;滴加二抗，PBS沖洗;滴加三抗，PBS沖洗;DAB染色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以已知陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 VEGF、Flt-1、KDR蛋白陽性細(xì)胞均表現(xiàn)為胞質(zhì)中棕黃色顆粒狀著色。在Olympus雙目顯微鏡高倍鏡下觀察并采集信號(hào)，使用Biosens Digital Imaging System v1.6圖像分析軟件分析圖像信號(hào)，用積分光密度(IOD)值表示染色的強(qiáng)弱[5]。每個(gè)樣本取5個(gè)視野的IOD，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行分析，3組VEGF、Flt-1和KDR蛋白IOD的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)分析分析SCC組織中3種蛋白表達(dá)的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

VEGF、Flt-1、KDR蛋白主要表達(dá)于腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞、表皮基底層以上除角質(zhì)層外的細(xì)胞以及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞。皮膚SCC、BCC及正常組織中3種蛋白的表達(dá)見圖1和表1。皮膚SCC組織中VEGF、Flt-1和KDR蛋白的表達(dá)高于皮膚BCC和正常組織，皮膚 BCC組織中3種蛋白的表達(dá)高于正常組織。

皮膚 SCC組織中 VEGF與 Flt-1(r=0.773，P ＜0.001)、VEGF 與 KDR(r=0.676，P ＜0.001)、Flt-1 與 KDR(r=0.718，P ＜0.001)的表達(dá)均呈正相關(guān)。

圖1 3種組織中VEGF(A)、Flt-1(B)及KDR(C)蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表1 皮膚正常、SCC及BCC組織中VEGF、Flt-1、KDR蛋白的表達(dá)

3 討論

通常認(rèn)為，腫瘤血管的生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要步驟之一。腫瘤血管新生是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種因子(促進(jìn)血管新生的正調(diào)節(jié)因子及抑制血管新生的負(fù)調(diào)節(jié)因子)的調(diào)控[6]。VEGF是重要的促血管生成因子[7]，多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞具有自分泌VEGF的功能。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最為強(qiáng)大和專一的刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生的因子，除此外，它還有增加血管通透性、趨化血管內(nèi)皮細(xì)胞等功能。VEGF及其受體Flt-1、KDR與腫瘤血管生成關(guān)系密切，不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，而且也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞[2-4]。研究[8]表明Flt-1與KDR的功能是有差異的，F(xiàn)lt-1與VEGF的親和力較高，KDR與VEGF的親和力較弱。Flt-1是最早發(fā)現(xiàn)的VEGF受體，對(duì)其生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)尚有爭(zhēng)論，目前認(rèn)為其主要作用為KDR的降解受體，起負(fù)向調(diào)節(jié)VEGF的作用，而在某些病理?xiàng)l件下又能發(fā)揮正向調(diào)節(jié)VEGF的作用;而大多數(shù)功能性內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過激活KDR來實(shí)現(xiàn)，包括刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用等[9]。該研究中，VEGF、Flt-1、KDR在皮膚BCC和SCC組織中的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，而且在血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞均有表達(dá)，提示VEGF及其受體Flt-1、KDR一方面作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管通透性增加及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管新生，另一方面可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂增殖。3者在皮膚SCC中的表達(dá)顯著高于在皮膚BCC中的表達(dá)，提示3種蛋白的表達(dá)可能與腫瘤的病理特點(diǎn)有關(guān)，BCC具有生長緩慢、很少轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。3種蛋白在SCC中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示VEGF及其受體Flt-1、KDR在腫瘤組織中存在協(xié)同作用，從而促進(jìn)腫瘤血管新生和腫瘤細(xì)胞增殖。因此可以通過干擾VEGF及其受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的各個(gè)環(huán)節(jié)抑制腫瘤的生長;VEGF及其受體有望成為皮膚腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

[1]Stratton SP.Prevention of non-melanoma skin cancer[J].Curr Oncol Rep，2001，3(4):295

[2]Lacal PM，Ruffini F，Pagani E，et al.An autocrine loop directed by the vascular endothelial growth factor promotes invasiveness of human melanoma cells[J].Int J Oncol，2005，27(6):1625

[3]Vieira JM，Santos SC，Espadinha C，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors in thyroid carcinomas of follicular origin:a potential autocrine loop[J].Eur J Pathol，2005，153(5):701

[4]Wey JS，F(xiàn)an F，Gray MJ，et al.Vascular endothelial growth factor receptor 1 promotes migration and invasion in pancreatic carcinoma cell lines[J].Cancer，2005，104(2):427

[5]李濤，范妤，劉芳.免疫組織化學(xué)圖像光密度分析的標(biāo)準(zhǔn)化方法[J].解剖學(xué)雜志，2008，31(5):727

[6]Stinga AC，Margaritescu O，Stinga AS，et al.VEGFR1 and VEGFR2 immunohistochemical expression in oral squamous cell carcinoma:a morphometric study[J].Rom J Morphol Embryol，2011，52(4):1269

[7]Bondo H.Vascular endothelial growth factor and bevacitumab in breast cancer[J].Breast Cancer，2007，14(2):163

[8]馬驪，王小寧，張智清，等.人血管內(nèi)皮生長因子受體配體結(jié)合域[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2000，32(5):463

[9]Roskoski R Jr.Vascular endothelial growth factor(VEGF)signaling in tumor progression[J].Crit Rev Oncol Hematol，2007，62(3):179