宋 璞 崔桂云 陳 偉 趙秋宸 花 放 沈 霞

1）徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)教研室（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科）徐州 221000 2）徐州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系 徐州 221000

腦組織缺血再灌注損傷（ischemia／reperfusion，I／R）一直是人們研究的熱點(diǎn)，近年來(lái)，已經(jīng)證實(shí)缺血部位的炎癥反應(yīng)參與I／R損傷［1］。而作為自身免疫炎癥相關(guān)性蛋白重要的一員，屬于IL－1R／TIR超家族的Toll樣受體家族（Toll like receptors，TLRs），可以識(shí)別特異性配體并激活相應(yīng)通路啟動(dòng)免疫反應(yīng)［2］。Hua等［3－4］已通過(guò)研究證實(shí)，TLR2和 TLR4可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的水平參與I／R損傷過(guò)程。且在本實(shí)驗(yàn)的前期實(shí)驗(yàn)中，Wan等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠經(jīng)全腦缺血再灌注后，其腦組織TLR3表達(dá)上調(diào)且存在時(shí)間依賴(lài)性。Préhaud等［5］在體外研究了人的神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)病毒感染起天然免疫反應(yīng)，利用狂犬病病毒感染人類(lèi)神經(jīng)元系細(xì)胞NT2－N發(fā)現(xiàn)TLR3mRNA及IFN－βmRNA表達(dá)均上調(diào)，提示TLR通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的水平參與I／R損傷過(guò)程，而且炎癥反應(yīng)有可能與神經(jīng)元細(xì)胞本身存在的TLR表達(dá)有關(guān)，同時(shí)，在一定條件干預(yù)下，如缺血再灌注、病毒感染等可影響其表達(dá)。poly（I：C）－LMW 為一人工合成的dsRNA片段，可特異性激活細(xì)胞上的TLR3。故本實(shí)驗(yàn)以離體大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對(duì)象，通過(guò)缺糖缺氧方法，在離體水平模擬缺血再灌注的病理生理過(guò)程，并通過(guò)poly（I：C）－LMW預(yù)處理等方法，檢驗(yàn)神經(jīng)元本身是否存在TLR3的表達(dá)，并觀察其表達(dá)在缺糖缺氧過(guò)程中的意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物孕18dSprague－Dawley（SD）大鼠，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑兔抗TLR3多克隆抗體（英國(guó)abcom公司），激動(dòng)劑poly（I：C）－LMW（美國(guó)InvivoGen公司），neuro－basal培養(yǎng)基及B27（美國(guó)GIBICO公司），無(wú)糖培養(yǎng)基（美國(guó)GIBICO公司），RT－PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司），Western blot所需二抗均由徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)及缺糖缺氧、激動(dòng)劑預(yù)處理方法原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)：孕18dSD大鼠，乙醚麻醉斷頭后，取胎鼠大腦皮質(zhì)，剪碎，胰酶37℃消化15min，胎牛血清終止消化。加入無(wú)血清培養(yǎng)基（neurobasal medium 100mL含有2mL B27，200mmol／L谷氨酰胺250μL，25μmol／Lβ－巰基乙醇45.5μL）反復(fù)吹打數(shù)次，200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1.2×10×5個(gè)／mL的密度接種于用多聚賴(lài)氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第4天換神經(jīng)元生長(zhǎng)培養(yǎng)基（neurobasal medium 100mL含有2mL B27，200mmol／L谷氨酰胺250μL），每周半換液2～3次。缺糖缺氧：取培養(yǎng)7d神經(jīng)元細(xì)胞，換無(wú)糖培養(yǎng)基后，放入缺氧培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，1%O2）培養(yǎng)2h后，更換新鮮神經(jīng)元生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，放回37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用于實(shí)驗(yàn)。激動(dòng)劑預(yù)處理：取培養(yǎng)7d神經(jīng)元細(xì)胞，更換新鮮神經(jīng)元生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，加入50μL 0.1mg／mL poly（I：C）－LMW，（若使用24孔板，則每孔加5μL 0.1mg／mL poly（I：C）－LMW）使工作液濃度達(dá)1μg／mL左右，預(yù)處理12h后，用于后續(xù)操作。

1.4實(shí)驗(yàn)分組將以上述方法培養(yǎng)7d的同批神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常組；OGD組（缺糖缺氧）；poly（I：C）組，予1μg／mL poly（I：C）預(yù)處理12h，不缺糖缺氧；OGD＋poly（I：C）組，予1μg／mL poly（I：C）預(yù)處理12h，缺氧復(fù)氧。

1.5 Western blot檢測(cè)TLR3表達(dá)各組細(xì)胞（n＝2），加入細(xì)胞裂解液約50μL加蛋白酶抑制劑2μL，冰上孵育30 min，細(xì)胞刮刀刮離，離心。用Lowry法測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白80μg經(jīng)120g／L SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)印，雜交，暗室內(nèi)掃描蛋白印跡條帶。

1.6 RT－PCR檢測(cè)TLR3mRNA表達(dá)

1.6.1 引物準(zhǔn)備：根據(jù)Genebank資料，利用primer premiers5.0引物設(shè)計(jì)軟件確定最優(yōu)引物，然后經(jīng)Blast匹對(duì)，同時(shí)選取β－actin作為內(nèi)參對(duì)照，引物由上海生工生物有限公司合成。見(jiàn)表1。

1.6.2 組織總RNA提?。喝‰x體培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，經(jīng)相應(yīng)預(yù)處理后，加入1mL TRNzol試劑，其后按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的RNA測(cè)定D260／OD280比值，讀數(shù)1.7～1.9認(rèn)為RNA純度達(dá)標(biāo)。

圖1 TLR3蛋白在不同組大鼠離體皮質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)情況

表1 PCR各引物序列及相關(guān)參數(shù)

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄：應(yīng)用cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.6.4 PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析：按照試劑說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，TLR3PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃3min；循環(huán)30次：94℃30s、56℃30s、72℃1min；終末延伸：72℃5 min。β－actin PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃3min；循環(huán)30次：94℃30s、60℃30s、72℃1min；終末延伸：72℃5min。

1.7免疫熒光各組細(xì)胞（以24孔板培養(yǎng)）移去培養(yǎng)基，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，0.5%Trioton－100透膜處理，PBS洗3次后封閉液封閉，0.1%tween－20洗3次后一抗孵育過(guò)夜，加二抗，0.1%tween－20后電鏡下觀察。

1.8圖像處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析蛋白及電泳條帶均采用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析，結(jié)果采用灰度比值表示，數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱狀圖采用Graph Pad Prism 5作圖軟件對(duì)于灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后生成。

2 結(jié)果

2.1 Western blot和RT－PCR結(jié)果及分析Western blot分析顯示缺糖缺氧組TLR3蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組與激動(dòng)劑預(yù)處理組，激動(dòng)劑預(yù)處理組TLR3蛋白表達(dá)水平比空白對(duì)照組高（P＜0.05），而缺糖缺氧組與激動(dòng)劑預(yù)處理后缺糖缺氧組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RTPCR分析顯示缺糖缺氧組TLR3蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組與激動(dòng)劑預(yù)處理組，激動(dòng)劑預(yù)處理組TLR3蛋白表達(dá)水平比空白對(duì)照組高（P＜0.05），而缺糖缺氧組與激動(dòng)劑預(yù)處理后缺糖缺氧組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1～4。

圖2 TLR3mRNA在不同組大鼠離體皮質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)情況

圖3 TLR3蛋白在不同組大鼠離體皮質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)的灰度比值（TLR3／β－actin）

圖4 TLR3mRNA在不同組大鼠離體皮質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)的灰度比值（TLR3mRNA／β－actin）

2.2免疫熒光結(jié)果免疫熒光顯示對(duì)照組及激動(dòng)劑組細(xì)胞狀態(tài)良好，呈類(lèi)圓形、多邊形，周?chē)休^多突起，連接成蛛網(wǎng)狀，視野下細(xì)胞數(shù)目較多，OGD組、激動(dòng)劑＋OGD組視野下細(xì)胞數(shù)目較少，且細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則并可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片，其中OGD組細(xì)胞損傷更為明顯。見(jiàn)圖5～9。

圖5 對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光情況

圖6 缺糖缺氧組神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光情況

圖7 激動(dòng)劑poly（I：C）－LMW預(yù)處理組神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光情況

圖8 激動(dòng) 劑 poly（I：C）－LMW預(yù)處理后缺糖缺氧組神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光情況

圖9 各組細(xì)胞數(shù)目比值（400倍）

3 討論

近年來(lái)，缺血再灌注損傷一直是人們研究的熱點(diǎn)，而本實(shí)驗(yàn)正是通過(guò)對(duì)離體神經(jīng)元缺糖缺氧的方法，體外模擬缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程，從而在離體神經(jīng)元細(xì)胞水平上，探究神經(jīng)元本身是否存在TLR3的表達(dá)，并觀察其表達(dá)在缺氧／復(fù)氧過(guò)程中的意義。

基于人們此前的研究，雖然現(xiàn)已提出包括鈣超載［6］、自由基損傷［7］、NO作用［8］等數(shù)種可能機(jī)制，但具體病理生理過(guò)程仍不明確。最近幾年，研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)向了缺血區(qū)域的炎癥反應(yīng)，通過(guò)研究，人們發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞的活化與募集［9］、各種炎性因子的釋放［10－11］都可以加重組織損傷，且Toll樣受體家族成員可以被死亡細(xì)胞釋放的熱休克蛋白、纖維蛋白原及DNA和RNA片段激活［12］，這提示Toll樣受體可以參與體內(nèi)的無(wú)菌性炎癥。針對(duì)于此，Hua等［3］通過(guò)研究證實(shí)TLR4在腦缺血再灌注損傷中被激活，而將TLR4基因敲除后可減輕腦損傷，這一作用可能通過(guò)調(diào)控TLR4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。然而，在對(duì)TLR4和TLR2的對(duì)比試驗(yàn)中提示兩者可能在腦缺血再灌注損傷中起到截然相反的作用，TLR2敲除小鼠在腦缺血后出現(xiàn)更為嚴(yán)重的癥狀，而TLR4敲除小鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度則明顯減輕［13］。Wan等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)大鼠經(jīng)全腦缺血再灌注后，其腦組織TLR3表達(dá)上調(diào)且存在時(shí)間依賴(lài)性。Préhaud等［5］利用狂犬病病毒感染人類(lèi)神經(jīng)元系細(xì)胞NT2－N發(fā)現(xiàn)TLR3mRNA及IFN－βmRNA表達(dá)均上調(diào)，基于以上研究成果，我實(shí)驗(yàn)小組大膽提出了TLR通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的水平參與I／R損傷過(guò)程，而且炎癥反應(yīng)有可能與神經(jīng)元細(xì)胞本身存在的TLR的表達(dá)有關(guān)，同時(shí)，在一定的條件干預(yù)下（如缺血再灌注、病毒感染等）可影響其表達(dá)。

TLR3可以識(shí)別病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的dsRNA而啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)［14］，死亡細(xì)胞產(chǎn)生的mRNA也可以成為T(mén)LR3的配體［15］，而 poly（I：C）－LMW 為一人工合成的 dsRNA 片段，可特異性激活細(xì)胞上的TLR3。缺氧／復(fù)氧實(shí)驗(yàn)是在離體水平模擬腦組織缺血再灌注損傷，以便更為直觀地研究某一種或幾種類(lèi)型的細(xì)胞在缺血再灌注損傷中病理生理過(guò)程的改變及作用。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，離體大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存在TLR3的表達(dá)，且缺氧／復(fù)氧及激動(dòng)劑poly（I：C）－LMW 均可使其表達(dá)上調(diào)，并觀察到，經(jīng)過(guò)poly（I：C）－LMW 預(yù)處理后的神經(jīng)元行缺氧／復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，通過(guò)免疫熒光觀察到其損傷水平輕于未行預(yù)處理的缺氧／復(fù)氧組，但重于僅經(jīng)預(yù)處理未行缺氧／復(fù)氧組及對(duì)照組，由此說(shuō)明，poly（I：C）－LMW 預(yù)處理可使神經(jīng)元細(xì)胞TLR3表達(dá)上調(diào)，并可在缺氧／復(fù)氧這一不利條件下，通過(guò)某些因素減輕細(xì)胞損傷。

再結(jié)合近年的研究進(jìn)展，炎癥反應(yīng)參與腦缺血／再灌注損傷機(jī)制，免疫炎癥在腦缺血／再灌注損傷中的作用已被大量研究證實(shí)，而Toll樣受體家族與免疫炎癥的緊密聯(lián)系使其獲得了人們的關(guān)注。TLR4是最早引起人們注意的家族成員，人們最先在肺臟、心臟、肝臟以及腎臟的缺血性損傷中認(rèn)識(shí)到了TLR4的存在［16－19］，隨后在腦缺血／再灌注損傷中也觀察到了TLR4的活化，隨后的研究中人們認(rèn)識(shí)到TLR4作為損傷因素參與I／R損傷。在體內(nèi)各臟器的缺血性損傷中TLR4作為損傷因素參與其病理生理過(guò)程，Hua等［3－4］的研究將Toll樣受體家族引入了缺血性腦損傷的研究范圍，當(dāng)下TLR4、TLR2、TLR9已先后被證實(shí)參與腦缺血／再灌注損傷。隨后對(duì)于TLR2的研究卻出現(xiàn)了與TLR4相反的現(xiàn)象。

而TLR3被激活后主要通過(guò) MyD88－非依賴(lài)性通路即TRIF通路而發(fā)揮作用，最終激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulator factor 3，IRF3）使其磷酸化后轉(zhuǎn)位入核誘導(dǎo)干擾素β（interferonβ，IFN－β）基因表達(dá)［20－21］，從而使細(xì)胞出現(xiàn)自身免疫炎癥反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷，而根據(jù)本實(shí)驗(yàn)可推斷，預(yù)先使用TLR3激動(dòng)劑poly（I：C）－LMW 處理，提高了神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性，且Ziegler、Hua等在早先進(jìn)行的關(guān)于TLR2的實(shí)驗(yàn)中亦得出了相似結(jié)果［22－23］。我們推測(cè)這可能是由于預(yù)處理組的神經(jīng)元在缺氧發(fā)生前TLR3表達(dá)升高，并通過(guò)某些橫向的通路聯(lián)系反饋抑制了下游的某些損傷性因子表達(dá)，或上調(diào)了某些保護(hù)性因子的表達(dá)，從而減輕了缺氧復(fù)氧后神經(jīng)元細(xì)胞自身免疫反應(yīng)，進(jìn)而減輕了細(xì)胞損傷。換言之，通過(guò)TLR3激動(dòng)劑poly（I：C）－LMW 對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元預(yù)處理，提高了細(xì)胞對(duì)于缺氧環(huán)境的耐受力，從而減輕了細(xì)胞損傷。

綜上所述，原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞本身存在TLR3的表達(dá)，且激動(dòng)劑預(yù)處理后，減輕原代皮質(zhì)神經(jīng)元在缺氧環(huán)境下的損傷，但造成此現(xiàn)象的縱向、橫向通路聯(lián)系及機(jī)制并不十分清楚，因而，TLR3及MyD88非依賴(lài)通路的激活對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

［1］Stoll G.Inflammatory cytokines in the nervous system：multifunctional mediators in autoimmunity and cerebral ischemia［J］.Rev Neurol（Paris），2002，158（10Pt 1）：887－891.

［2］Aderem A，Ulevitch RJ.Toll－like receptors in the induction of the innate immune response［J］.Nature，2000，406（6797）：782－787.

［3］Hua F，Ma J，Ha T，et al.Activation of Toll－like receptor 4 signaling contributes to hippocampal neuronal death following global cerebral ischemia／reperfusion［J］.J Neuroimmunol，2007，190（1／2）：101－111.

［4］Hua F，Ma J，Ha TZ，et al.Differential Roles of TLR2and TLR4in acute focal cerebral ischemia／reperfusion injury in mice［J］.Brain Res，2009，1262：100－108.

［5］Préhaud C，Mégret F，Lafage M，et al.Virus infection switches TLR－3－positive human neurons to become strong producers of beta interferon［J］.J Virol，2005，79（20）：12 893－12 904.

［6］Dirnagl U，Iadecola C，Moskowitz MA.Pathobiology of ischaemic stroke：an integrated view［J］.Trends Neurosci，1999，22：391－397.

［7］Loh KP，Huang SH，De Silva R，et al.Oxidative stress：apoptosis in neuronal injury［J］.Curr Alzheimer Res，2006，3：327－337.

［8］Kilic E，Kilic U，Matter CM，et al.Aggravation of focal cerebral ischemia by tissue plasminogen activator is reversed by 3－h(huán)ydroxy－3－methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor but does not depend on endothelial NO synthase［J］.Stroke，2005，36（2）：332－336.

［9］David Brea Tomás，Sobrino Pedro，Ramos－Cabrer.Inflammatory and neuroimmunomodulatory changes in acute cerebral ischemia［J］.Cerebrovasc Dis，2009，27（suppl 1）：48－64.

［10］Mabuchi T，Kitagawa K，Ohtsuki T，et al.Contribution of microglia／macrophages to expansion of infarction and response of oligodendrocytes after focal cerebral ischemia in rats［J］.Stroke，2000，31（7）：1 735－1 743.

［11］Zhu Y，Yang GY，Hlemeyer B，et al.Transforming growth factor－beta 1increases bad phosphorylation and protects neurons against damage［J］.J Neurosci，2002，22：3 898－3 909.

［12］Marshak－Rothstein A.Toll－like rece ptors in systemic autoimmune disease［J］.Nat Rev Immunol，2006，6（11）：823－835.

［13］Aderem A，Ulevitch RJ.Toll－like receptors in the induction of the innate immune response［J］.Nature，2000，406（6797）：782－787.

［14］Katherine AF，Sarah MM，Kerrie LF，et al.IKK epsilon and TBK1are essential components of the IRF－3signaling pathway［J］.Nat Immunol，2003，4（5）：491－496.

［15］Kariko K，Ni H，Capodici J，et al.mRNA is an endogenous ligand for Toll－like receptor 3［J］.J Biol Chem，2004，279：12 542－12 550.

［16］Kim BS，Lim SW，Li C，et al.Ischemia－reperfusion injury activates innate immunity in rat kidneys［J］.Transplantation，2005，79：1 370－1 377.

［17］Ha T，Hua F，Li Y，et al.Blockade of MyD88attenuates cardiac hypertrophy and decreases cardiac myocyte apoptosis in pressure overload induced cardiac hypertrophy in vivo［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290：H985－H994.

［18］Zhai Y，Shen X，O＇Connell R，et al.Edge：TLR4activation mediates liver ischemia／reperfusion inflammatory response via IFN regulatory factor 3－dependent MyD88－independent pathway［J］.J Immunol，2004，173：7 115－7 119.

［19］Kim BS，Lim SW，Li C，et al.Ischemia－reperfusion injury activates innate immunity in rat kidneys［J］.Transplantation，2005，79：1 370－1 377.

［20］Sharma S，Tenoexer BR，Grandvaux N，et al.Triggering the interferon antiviral response through an ikk－related pathway［J］.Science，2003，30（12）：1 148－1 151.

［21］Farina C，Aloisi F，Meinl E.Astrocytes are active plays in cerebral innate immunity ［J］.Trends Immunol，2007，28（3）：138 214.

［22］Ziegler G，Harhausen D，Schepers C，et al.Tlr2has a detrimental role in mouse transient focal cerebral ischemia［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359：574－579.

［23］Hua F，Ma J，Ha TZ，et al.Preconditioning with a TLR2 specific ligand increases resistance to cerebral ischemia／reperfusion injury［J］.J Neuroimmunol，2008，199（1／2）：75－82.